Как определяют чувствительность бактерий к антибиотикам

Что такое бактериологический посев

Бактериологический посев (культуральное или микробиологическое исследование) — лабораторное исследование,при котором биоматериал,в котором предположительно могут находиться патогенные микроорганизмы,помещают в благоприятную для их размножения среду при определенных
температурных параметрах с последующей оценкой результатов и определения чувствительности к антибактериальным препаратам.

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) из-за высокой цены и длительного срока проведения не рекомендует применять культуральное исследование в повседневной практической практике при наличии других методов диагностики (окраска по Граму,ПЦР) и при выраженной клинической картине заболевания.

Метод ценен для определения условно-патогенной микрофлоры,определения чувствительности к антибиотикам.Постепенно в практике заменяется полимеразной цепной реакцией (ПЦР)Преимуществом культурального метода явялется относительно высокая специфичность исследования и возможность лабораторного моделирования терапевтического воздействия на микроорганизмы и учет его эффективности — т.е. то,что обычно называют антибиотикограммой.Недостатками являются длительность исследования,высокие
требования к забору материала,повышенные требования к квалификации персонала лабораторий,что ведет к значительному удорожанию стоимости исследования и удлинению сроков лечения.Лично я скептически отношусь к проведению различных бактериологических исследований,так как в большинстве случаев проблему излечения пациента удается решить в сроки,когда результаты бактериологического исследования еще не готовы.

Как проводится бактериологический посев

Материал  для исследования:отделяемое из очагов поражения.Материал может браться не только из половых органов,но и из полости рта,прямой
кишки.Правила забора аналогичны забору при ПЦР-диагностике.Сроки выполнения различны от нескольких дней до нескольких недель(зависят от определяемого возбудителя).Для забора материала используются стерильные специальные инструменты или тампоны.Материал помещают в транспортную среду,если забор проводится вне лаборатории и  в дальнейшем его помещают в специальные питательные среды.В зависимости от задач исследования применяют множество сред с добавлением различных биопрепаратов
и химических соединений.Питательная среда с внесенным материалам помещается в специальные приборы(термостаты),в которых создается и автоматически поддерживаются условия,необходимые для размножения микроорганизмов (температура,влажность,газовая смесь и.т.д.).По истечению определенного времени  проводят контрольные проверки-осмотры питательных среды.Рост микроорганизмов происходит в виде так называемых колоний,обладающих видимыми характеристиками — размер,плотность,форма,цвет и.т.д.При необходимости проводится
микроскопическое исследования материала,взятого из колоний с окраской специальными красителями.Для того,чтобы дифференцировать микроорганизмы,сходные по типу колоний и (или) микроскопической картине проводят дополнительное исследования по способностям микроорганизмов разлагать некоторые неорганические и органические соединения — так называемое исследование с помощью биохимического ряда.Для определения количественных показателей используют различные методы,о которых сказано ниже.Выделенный и определенный
микроорганизм называют культурой.Задача упрощается в тех,случаях,когда посев материала проводят на специальные среды,на которых могут размножаться только определенные виды микробов.(например среда Маккоя для определения хламидий).

Какие показания к проведению бактериологического посева

В современной венерологии редко приходится прибегать к бактериологическому методу исследования.По моему мнению в России отмечается некоторое злоупотребление этим методом,связанное с коммерческим интересами лабораторий и нежеланием или незнанием врачами методов синдромной диагностики и лечения половых инфекций.Несомненными
показаниями к проведению бактериологического исследования являются два заболевания : воспалительные заболевания малого таза у женщин и простатит у мужчин.С юридической точки зрения бактериологическое подтверждение диагноза гонококковой инфекции требуется при обнаружении в мазке грамотрицательных диплококков у девочек, пожилых женщин и беременных .В некоторых случаях исследование необходимо
при хроническом,торпидном уретрите у мужчин и рецидивирующем вульвовагините у женщин.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРОБОВ К АНТИБИОТИКАМ

Многие бактерии и грибки продуцируют вещества — антибиотики, угнетаю­щие жизнедеятельность микробов других видов, в том числе патогенных. Анти­биотики известны против всех возбудителей бактериальных инфекций. Каждый антибиотик имеет свой антимикробный спектр действия. Но чувствительность бактерий к антибиотику может снизиться или даже исчезнуть за счет появления резистентных вариантов у данного вида микробов. Поэтому при возникновении бактериальной инфекции необходимо определить степень чувствительности ее возбудителя к антибиотикам с тем, чтобы подобрать из них наиболее эффек­тивный для целее и лечения и профилактики данной инфекции. Активность анти­биотика измеряется в единицах действия (ЕД).

Для определения чувствительности микробов к антибиотикам чаще при­меняют метод диффузии в агар с использованием дисков, содержащих антибио­тики, и метод серийных разведений в жидкой и плотной питательной среде.

Метод диффузии в агар с применением дисков

Он прост в выполнении и позволяет быстро получить результат, что весьма важно для срочного проведе­ния противоэпизоотических мероприятий

Пробу ставят в чашках с 2%-ным МПА или агаром Хоттингера, содержащим 120-140 мг% аминного азота, или на специальных плотных средах с оп­тимальным для каждого микроба рН. Среду наливают в чашки по 20 мл следя чтобы слой агара был равномерным и толщиной не менее 4-5 мм. После застывания агара на дно чашек наносят 4-5 точек на равном удалении друг от дру­га, в 2,5 см от центра и в 2 см от края чашки.

Смыв с каждой испытуемой агаровой культуры доводят до концентрации 10-20 единиц мутности по оптическому стандарту. 1 мл, взвеси вносят в отдель­ную чашку и покачиванием распределяют по всей поверхности агара остаток отсасывают пипеткой. Чашки с посевами подсушивают при 370С в течение 20­-25 мин.

С помощью пинцета диски с одним антибиотиком раскладывают по чашкам в намеченные точки и слегка прижимают их к среде. Перед раскладыванием дис­ков с каждым другим антибиотиком конец пинцета протирают спиртом и флам­бируют. Посевы с дисками выдерживают 3 ч при, комнатной температуре. За это время диффузия антибиотиков в агар в основном заканчивается. Наиболь­шие концентрации антибиотиков будут под дисками, а по мере удаления от дисков они уменьшаются. Затем чашки ставят вверх дном в термостат при 370С на 16-18 ч.

Учет результатов. В зависимости от чувствительности микроба вокруг диска образуется большая или меньшая зона задержки роста на фоне сплошного газона культуры. С помощью металлической линейки или полоски миллиметро­вой бумаги измеряют по дну чашки диаметры зон задержки роста, включая размер дисков. Если зона больше 25 мм, микроб высокочувствителен к данно­му антибиотику; при размере зоны 15-25 мм микроб чувствителен; если диа­метр зоны 11-14 мм, микроб малочувствителен, а при меньшем размере зоны илн полном отсутствие задержки роста микроб устойчив к антибиотику. Рост от дельных колоний испытуемого микроба в пределах зоны свидетельствует о наличии в культуре устойчивых к антибиотику особей.

Стандартные бумажные диски имеют диаметр 5 мм и пропитаны антибио­тиками в такой концентрации, которая подавляет рост чувствительных микробов в зоне диаметром 28-32 мм. Хранят диски в плотно закрытых склянках или флаконах в сухом месте при комнатной температуре.

Пригодность новых партий питательных сред и дисков с антибиотиками к постановке пробы проверяют с соответствующими для каждого антибиотика тест микробами.

Необходимо употреблять питательные среды с одинаковым содержанием агар-агара, аминоазота и рН, пользоваться чашками с ровным дном и одина­ковой толщиной агара. При нарушении этих условий диаметр зоны может из­мениться на 6-10 мм. Не следует брать в опыт микробы, дающие скудный или наоборот, обильный и ползучий рост. Срок между посевом культур и наложением дисков не должен превышать 30 мин.

При выявлении устойчивых к антибиотикам культур микробов проводят кон­трольные исследования методом серийных разведений в соответствии с методи­ческими указаниями по определению чувствительности к антибиотикам возбуди­телей инфекционных болезней сельскохозяйственных животных.

studopedia.ru

Что такое колониеобразующие единицы (КОЕ)

Колониеобразующая
единица (colony-forming unit -CFU) — одна живая микробная клетка, из которой вырастает колония,по другим определениям — видимая колония микроорганизмов, выросшая из одной клетки или из группы клеток.Определение КОЕ теоретически позволяет определить концентрацию(количество)  микроорганизмов в единице объема.Если определения количества микроорганизмов например в 1 мл мочи или в 1 мл спермы не вызывает возражений и может приниматься во внимание при определении тактики лечения
заболевания,то количественное определение микроорганизмов в отделяемом из половых органов (влагалища,уретры) вызывает большие сомнения — так в любом случае,независимо от методов подсчета,определяется количество микроорганизмов только во взятой пробе из половых органов,а не во влагалище,цервикальном канале или уретре в целом

Поэтому определение различных «титров», «степеней»,»количества» микроорганизмов в пробах,взятых из отделяемого влагалища и уретры не имеет никакого практического значения ни для диагностики мочеполовых инфекций,ни для назначения лечения,ни для контроля их излеченности.

Подсчет КОЕ проводят
несколькими методами:

Метод серийный разведений

Из транспортной среды,содержащей биоматериал берется 1 мл,который последовательно разбавляется в 10 раз с посевом в пронумерованные пробирки с питательной средой.Та пробирка,в которой прекращается рост микроорганизмов считается максимальной границей количества микроорганизмов в пробе.Для примера количество концентрация микроорганизмов в нижеприведенной таблице составляет 10х 6

№	10×1	10×2	10×3	10×4	10×5	10×6	10×7	10×8	10×9
рост	+	+	+	+	+	+	—	—	—

Этот же метод серийных разведений
применяется для определения чувствительности к антибиотикам (определяется минимальная ингибирующая концентрация)

Метод подсчета колоний под микроскопом

Метод является ориентировочным и заключается в подсчете колоний под микроскопом под увеличение 10 х в поле зрения с последующей интерпретацией по сравнительной таблице.

Количество колоний	Концентрация в КОЕ/мл
1	10 x 3
1-5	10 x 4
5-15	10 x 5
>15	10 x 6

Секторный метод (метод Gould)

По существу является вариантом метода серийных разведений.Применяется для микробиологического исследования мочи.Платиновой петлей диаметром 2 мм, емкостью 0,005 мл берут каплю мочи и делают 30-40 штрихов на сектор А чашки Петри. Прожигают петлю и производят 4
штриха через сектор А в сектор I. Аналогичным образом из сектора I засеваютсектор II, а из сектора II — сектор III.Чашки инкубируют при 37 оС24 часа. При отсутствии роста на кровяном агаре инкубацию пролонгируют до 3 суток.Учет результатов проводят по специальнойтаблице.

А	1 сектор	2 сектор	3 сектор	кол-во в 1 мл
1-6	—	—	—	<1000
8-20	—	—	—	3000
20-30	—	—	—	5000
30-60	—	—	—	10000
70-80	—	—	—	50000
100-150	5-10	—	—	100000
не сосч.	20-30	—	—	500000
-«-	40-60	—	—	1 млн
-«-	100-150	10-20	—	5 млн
-«-	не сосч.	30-40	—	10 млн
-«-	-«-	60-80	ед.кол.	100 млн

Показания для исследования чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам

В ходе повседневной деятельности в бактериологических лабораториях из различных биологических материалов и объектов внешней среды выделяют множество бактерий, относящихся к различным таксономическим группам. Однако определение чувствительности выделенных микроорганизмов к АБП показано далеко не во всех случаях. Определение показаний для исследования чувствительности микроорганизмов к АБП является обязанностью врача-бактериолога.

Определять чувствительность к АБП представителей нормальной микрофлоры человека, при их выделении из естественных мест обитания, бактерий, выделенных из объектов внешней среды, за исключением случаев проведения специальных исследований, нецелесообразно.

Обязательному исследованию на чувствительность к АБП подлежат все микроорганизмы, выделенные из первично стерильных жидкостей, органов и тканей человека. В остальных случаях оценке чувствительности должна предшествовать оценка клинической значимости выделенного микроорганизма.

Определение чувствительности выделенного штамма микроорганизма показано, если уровень его устойчивости к АБП не может быть предсказан на основании данных идентификации или вероятной таксономической принадлежности микроорганизма

Практически важной задачей является выявление приобретенной резистентности к АБП у природно-чувствительных к ним микроорганизмов. Подтверждение природной чувствительности или резистентности микроорганизма к АБП не является целью практических исследований

Исследованию по оценке антибиотикочувствительности подлежат чистые культуры микроорганизмов или материал изолированных колоний с плотных питательных сред после первичного посева образца клинического материала, в последнем случае параллельно необходимо провести идентификацию культуры.

При обнаружении на плотных питательных средах после первичного посева смешанной культуры исследовать антибиотикочувствительность до идентификации и оценки этиологической значимости отдельных микроорганизмов нецелесообразно.

Прямое определение чувствительности с использованием клинического материала (без выделения чистой культуры) возможно только в исключительных случаях при условии подтверждения однородности культуры и высокой степени обсемененности при окраске по Граму, причем исследование следует повторить после выделения чистой культуры микроорганизма.

Следует уделять особое внимание определению чувствительности микроорганизмов, относящихся к таксономическим группам, для которых характерна высокая частота распространения приобретенной резистентности. У микроорганизмов, проявляющих универсальную чувствительность к каким-либо АБП, т.е

когда случаев резистентности не описано (например, Streptococcus pyogenes — все штаммы чувствительны к пенициллину), проводить определение чувствительности к этим препаратам в повседневной практике нецелесообразно

У микроорганизмов, проявляющих универсальную чувствительность к каким-либо АБП, т.е. когда случаев резистентности не описано (например, Streptococcus pyogenes — все штаммы чувствительны к пенициллину), проводить определение чувствительности к этим препаратам в повседневной практике нецелесообразно.

Факты выявления резистентности у микроорганизмов, для которых этот феномен ранее не был описан в научной литературе, следует оценивать с крайней осторожностью и рекомендуется обращаться за консультациями в лаборатории, занимающиеся изучением антибиотико-резистентности. Не следует в практических целях исследовать микроорганизмы, для которых методы определения чувствительности в настоящее время не стандартизованы и отсутствуют критерии интерпретации результатов

Результаты, полученные в данном случае, не могут служить основанием для назначения антибактериального препарата, если соответствующая нозологическая форма не приведена в утвержденной инструкции по его применению

Не следует в практических целях исследовать микроорганизмы, для которых методы определения чувствительности в настоящее время не стандартизованы и отсутствуют критерии интерпретации результатов. Результаты, полученные в данном случае, не могут служить основанием для назначения антибактериального препарата, если соответствующая нозологическая форма не приведена в утвержденной инструкции по его применению.

Новые методы определения чувствительности бактерий к химиопрепаратам. Автоматические системы учёта результатов метода серийных разведений. Е-тест.

В настоящее время разработаны компьютеризованные системы, автоматически проводящие выделение бактерий из исследуемых образцов и определяющие их чувствительность к различным ЛС. Их основное достоинство — освобождение персонала бактериологических лабораторий от большого объёма рутинных исследований и чёткая стандартизация полученных результатов.

Широкое распространение этих устройств в отечественной практике ограничивает их стоимость. Среди более доступных методов наибольшее распространение нашли система Alamar и Е-тест, совмещающие в себе достоинства метода серийных разведений и метода дисков.

Автоматические системы учёта результатов метода серийных разведений (например, Baxter MicroScan AutoSCAN-4) — автоматизированные инкубационные системы со встроенными фотометрами, нефелометрически регистрирующими рост бактерий или его отсутствие через 24 ч после внесения микроорганизмов в лунки микропанелей. Принцип действия основан на учете разницы оптической плотности среды в лунках, где есть рост бактерий, и в лунках, где его нет. В настоящее время разработаны устройства (например, VITEK), позволяющие получить результаты уже через 4-10 ч.

Система Alamar представляет собой панель с лунками, в каждую помещены диски из фильтровальной бумаги, содержащие различные концентрации антимикробных препаратов и пропитанные индикатором Alamar Blue. После внесения в лунку бактерий диск синеет, а при их дальнейшем росте его окраска меняется на розовую. Порядок размещения дисков в лунках соответствует двойным серийным разведениям препарата. Последняя лунка с синим диском, предшествующая лункам с порозовевшими дисками, соответствует МИК препарата.

Е-тест — модификация метода дисков, но вместо последних используют полоски из фильтровальной бумаги, пропитанной различными концентрациями препаратов, каждая из этих зон имеет соответствующую маркировку. Полоски помещают на поверхность агара. Если бактерии чувствительны к действию препарата, вокруг участков полоски, содержащих его ингибирующие концентрации, образуется эллипсовидная зона. Её форма обусловлена действием сразу нескольких концентраций препарата. МИК соответствует участок полоски, где её пересекает граница зоны задержки роста.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним. См. подробнее в пользовательском соглашении.

Артикул: 412334Производитель: bioMerieux SAФасовка: 30 штНазначение: Etest является количественным методом определения антимикробной чувствительности грамотрицательных и грамположительных аэробных бактерий. Система состоит из стандартного градиента антибиотика, который используется для определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК), выраженной в μг/мл. посредством культивирования на питательном агаре в течение ночи. Фасовка (кол-во полосок (стрипов) в упаковке): 30 Материал фасовки: индивидуальная упаковка Температура хранения: + 4°C — +20°C

Условия покупки

Методика градиента Etest комбинирует метод разведений и принципы диффузии при определении чувствительности. Как и другие методы разведений, Etest непосредственно выражает антимикробную чувствительность количественно в виде отдельных значений МИК. Однако, используя стандартный, стабильный и постоянный градиент концентрации антибиотика, с помощью Etest можно получить более точные и воспроизводимые значения МИК, чем результаты, полученные при традиционном методе, основанном на прерывистом двукратном серийном разведении.

Заказная позиция Нормативный максимальный срок поставки (календарных дней): информация по запросу у поставщика Фасовка: 30 шт Регистрационное удостоверение: ФСЗ 2010/08614 Сертификат/декларация соответствия: Не подлежит обязательной сертификации Класс опасности: Не опасный Остаточный срок годности, признаваемый годным (дней): 250 Вес (нетто): 0,046 кг. Объем (нетто): 0,000304 куб.м. Транспортировка при: -20°C +08°C Условия хранения: -20°C +08°C

• Карьера. Психология труда и отношения на работе

    

• Как определяется острота зрения у маленьких детей?

    

• Железодефицит или железодефицитная анемия: разбираемся в проблеме с терапевтом

    

• Операции на поджелудочной железе. Операции при панкреатите. Операции при опухолях поджелудочной железы.

    

• Как приготовить кекс на кефире быстро и вкусно — лучшие рецепты кексов

Макрометод

Процедура

Тестирование проводится в объеме 1 мл каждого разведения АБП с конечной концентрацией исследуемого микроорганизма примерно 5 x 10 5 КОЕ/мл.

Питательная среда

Питательный бульон для определения чувствительности разливают по 0,5 мл в каждую пробирку. Количество пробирок определяется необходимым диапазоном разведений АБП и увеличивается на одну для постановки «отрицательного» контроля.

Приготовление серийных разведений АБП (рис. 1)

Рабочий раствор АБП готовят из основного раствора с использованием жидкой питательной среды. Концентрацию рабочего раствора рассчитывают исходя из необходимой максимальной концентрации в ряду серийных разведений, учитывая фактор разбавления препарата при последующей инокуляции. Затем рабочий раствор в количестве 0,5 мл при помощи микропипетки со стерильным наконечником вносят в первую пробирку, содержащую 0,5 мл бульона. Тщательно перемешивают и новым стерильным наконечником переносят 0,5 мл раствора АБП в бульоне во вторую пробирку, содержавшую первоначально 0,5 мл бульона. Эту процедуру повторяют, пока не будет приготовлен весь необходимый ряд разведений. Из последней пробирки 0,5 мл бульона удаляют.

Таким образом, получается ряд пробирок с растворами АБПов, концентрации которых отличаются в соседних пробирках в 2 раза. Одновременно готовятся дополнительные ряды серийных разведений АБП для тестирования контрольных штаммов. Серия разведений обязательно должна включать в себя пограничные концентрации и допустимые диапазоны МПК для контрольных штаммов.

Приготовление инокулюма и инокуляция

Для инокуляции используют стандартную микробную взвесь, эквивалентную 0,5 по стандарту МакФарланда, разведенную в 100 раз на питательном бульоне, после чего концентрация микроорганизма в ней составит примерно 10 6 КОЕ/мл.

По 0,5 мл инокулюма вносят в каждую пробирку, содержащую по 0,5 мл соответствующего разведения АБП, и в одну пробирку с 0,5 мл питательного бульона без антибиотика («отрицательный» контроль). Конечная концентрация микроорганизма в каждой пробирке достигнет необходимой — примерно 5 x 10 5 КОЕ/мл. Инокулюм должен быть внесен в пробирки с разведениями АБП не позднее 15 — 30 мин. с момента приготовления.

Инкубация

Пробирки закрывают стерильными ватно-марлевыми пробками или металлическими колпачками, и все пробирки с тестируемыми штаммами, кроме пробирки «отрицательный» контроль, инкубируются в обычной атмосфере при температуре 35 °С в течение 16 — 20 или 20 — 24 ч (в зависимости от вида тестируемого микроорганизма). Пробирка «отрицательный» контроль помещается в холодильник при + 4 °С, где хранится до учета результатов.

Учет результатов

Для определения наличия роста микроорганизма пробирки с посевами просматриваются в проходящем свете. Рост культуры в присутствии АБП сравнивается с референтной пробиркой («отрицательный» контроль), содержащей исходный инокулюм и хранившейся в холодильнике. МПК определяется по наименьшей концентрации АБП, которая подавляет видимый рост микроорганизма.

Рисунок 1

Общие сведения

Определение чувствительности микроорганизмов — возбудителей инфекционных заболеваний человека к антибактериальным препаратам (АБП) — приобретает все более важное значение в связи с появлением и широким распространением антибиотико-резистентности у бактерий. Стандартные методы определения чувствительности микроорганизмов к АБП (диско-диффузионный и серийных разведений) были разработаны во второй половине 60-х — начале 70-х годов XX века и с тех пор с методической точки зрения не претерпели принципиальных изменений

Однако внедрение в клиническую практику значительного количества новых АБП и появление новых механизмов антибиотико-резистентности у микроорганизмов потребовало более строгой стандартизации процедуры тестирования, разработки новых подходов к интерпретации результатов, внедрения современной системы внутреннего контроля качества на каждом этапе исследования.

В настоящих методических указаниях систематизированы современные подходы к определению чувствительности бактериальных возбудителей инфекционных заболеваний человека, учитывающие рекомендации Европейского комитета по определению чувствительности к антибиотикам, а также Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам США.

Исследования чувствительности микроорганизмов к АБП осуществляются для решения следующих задач:

— обоснование целенаправленной индивидуальной антибактериальной терапии для лечения конкретной инфекционной болезни отдельным пациентам;

— обоснование эмпирической терапии отдельных нозологических форм инфекционных болезней в пределах лечебных учреждений или географических регионов;

— осуществление наблюдения за распространением антибиотико-резистентности в отдельных учреждениях или географических регионах;

— исследование новых химических соединений на наличие антибактериальной активности.