Примечания[ | код]
- ↑A. H. Coons, H. J. Creech, R. N. Jones, E. Berliner (нем.)русск., The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody, J. Immunol.45, 1942, pp. 159—170
- ↑A. H. Coons, M. H. Kaplan, Localization of antigen in tissue cells. II. improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody, J. Exp. Med., 91(1), pp. 1-13
- ↑On-Chip Cytometry using Plasmonic Nanoparticle Enhanced Lensfree Holography : Scientific Reports : Nature Publishing Group
Метод флуоресцирующих антител (МФА) (иначе реакция иммунофлуоресценции – РИФ) используется для обнаружения антигенов в биологических объектах (микроорганизмах, жидкостях) с помощью антител, помеченных флуоресцирующими красителями.
Первый люминесцентный микроскоп с кварцевой оптикой был сконструирован еще в 1908г. Келером и Зидентопфом. Сам метод иммунофлуоресценции был изобретен в 1942г. А. Кунсом, синтезировавшим органический краситель флуоресцеин-4-изоцианат, и разработавшим методику его конъюгирования с сывороточными белками.
Различают прямой (пМФА) или реакция прямой иммунофлуоресценции (РПИФ), разработан. А Кунсом и Каплан. Непрямой (нМФА) метод флуоресцирующих антител или реакция непрямой иммунофлуоресценции (РнИФ), разработан Кунсом и Уиллером и, как разновидность последнего нМФА с комплементом.
ПМФА используется с целью выявления антигенов в биологических пробах на основе известных сывороток.
Методика пМФА. На предметном стекле фиксируется мазок или отпечаток ткани, содержащий антиген. На этот мазок наносится флуоресцирующая сыворотка, содержащая антитела против предполагаемого антигена. В качестве контроля используется гетерологичная флуоресцирующая сыворотка. В течение 30 мин.мазки с нанесенной сывороткой выдерживают во влажной камере при +37°С затем их промывают, удаляя лишний флуоресцин. Сыворотка, связываясь с антителом, образует комплекс, включающий флуоресцин, как опознавательный маркер. Оценка результатов осуществляется люминесцентным микроскопированием по уровню яркости зеленого свечения, описывается в крестах.
“+++++” – яркая, сверкающая флуоресценция;
“+++” – отчетливо выраженная, достаточно яркая флуоресценция;
“++” — флуоресценция слабая, но морфология клеток и цвет люминесценции выявляется достаточно четко;
“+” — флуоресценция очень слабая, морфология клеток различима плохо;
“-” – флуоресценция отсутствует.
НМФА используется с целью выявления специфических антител в биологических пробах.
Методика нМФА. При проведении нМФА на известный, фиксированный на стекле антиген, наносят испытуемую сыворотку и в течение 30 мин. мазки с нанесенной сывороткой выдерживают во влажной камере при +37°С. Затем наносят антивидовой (соответствующий испытуемой сыворотке) люминесцирующий гамма-глобулин и вновь выдерживают во влажной камере. Далее препараты промывают, высушивают и исследуют люминесцентной микроскопией. Титром сыворотки считают то наибольшее ее разведение, которое обусловливающее свечение на “++”, при наличии свечения на “+++” или “++++” в предыдущем разведении.
Модификацией нМФА, является нМФА с комплементом. В этом случае к сыворотке, нанесенной на антиген, добавляется комплемент, а к нему уже антикомплементарная люминесцирующая сыворотка.
Преимуществом непрямых методов является необходимость наличия только видовых люминесцирующих сывороток. При этом реакция становится более громоздкой из-за большого количества необходимых контролей. К недостаткам всех видов РИФ относится ограниченная чувствительность из-за наличия возможных перекрестных реакций между близкими по антигенному составу объектами и неспецифическая флуоресценция вследствие адсорбции флуоресцирующей сыворотки на различных элементах препарата.
РИФ применяется в настоящее время для идентификации возбудителей различных вирусных инфекций, бешенства, колиэнтеритов, дизентерии, гепатита, брюшного тифа и паратифов, холеры, коклюша, чумы, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы, сифилиса, токсоплазмоза, хламидиоза, и др.
Для лабораторных исследований используются коммерческие стандартные конъюгаты, содержащие глобулины к исследуемым антигенам.
Список литературы:
1. Р. Кирк Д. Бонагура Современный курс ветеринарной медицины Кирка. М., “Аквариум” 2005г.
2. Х.Г. Ниманд П.Ф. Сутер Болезни собак. М., “Аквариум” 1998г.
3. Бусыгин К.Ф. Люминесцентная диагностика инфекционных болезней животных М., “Колос” 1975г.
4.Сюрин В.М Самуйленко А.Я. и др.
Значение и перспективы метода[ | код]
Метод имеет решающее значение в ранней диагностике и лечении онкологических заболеваний (иммуногистохимия, онкогематология), диагностике инфекционных заболеваний (например определение CD4+ клеток при ВИЧ) и наследственных синдромов. Интенсивно развиваются автоматизированные методы, среди которых направления высокоинформативной микроскопии (high content imaging) и высокоинформативной цитометрии(high content cytometry),параллельно развивающиеся с 90х годов комбинированные методики цитометрии-микроскопии (цитометр-микроскоп), а также методы микрочиповой цитометрии с плазмонной голографией в которых отдельные антитела метятся наночастицами.
Иммунофлуоресцентный анализ
Третий этап: комплекс антиген — антитело — комплемент обрабатывают люминесцирующей антикомплементарной сывороткой, приготовленной при иммунизации кроликов сывороткой того вида животного, которое служило источником комплемента.
Непрямые варианты МФА можно использовать как для выявления антигенов, так и для определения антител. Кроме того, для постановки двухступенчатого варианта нужно иметь ограниченный набор антивидовых люминесцирующих сывороток (против глобулинов быка, барана, лошади, свиньи и др.), а для антикомплементарного варианта достаточно иметь всего одну люминесцирующую сыворотку против глобулинов морской свинки.
Методика иммунолюминесцентной микроскопии. В практике ветеринарных бактериологических лабораторий используют люминесцирующие сыворотки биофабричного производства. В зависимости от типа флуорохрома люминесцирующие сыворотки обеспечивают либо зеленое свечение объекта (краситель на основе флуоресцеина), либо красное (краситель на основе родамина).
Для проведения иммунолюминесцентной микроскопии следует на обезжиренное тонкое без царапин предметное стекло нанести исследуемый материал. При исследовании органов и тканей животных готовят препараты-отпечатки тонким слоем. Препараты подсушивают на воздухе и помещают в фиксирующую жидкость (этанол — 15 мин, метанол — 5 мин, ацетон — 5 мин). Если необходимо, после фиксации препараты некоторое время можно сохранять в холодильнике. Последовательность и дальнейшие процедуры зависят от применяемого варианта МФА
Реакция нейтрализации. Используется только для определения принадлежности бактерийных токсинов в исследуемом материале для установления активности антитоксических сывороток. В пробирки с равным количеством антигена (в 1мл, например, 1000 смертельных доз столбнячного токсина) добавляют равный объем убывающего количества (убывающей концентрации) специфической гипериммунной антитоксической сыворотки; пробирки помещают в термостат на 1-2 ч. Затем из каждой пробирки смесь-токсин-антитоксин вводят лабораторным животным (по 2 животных на каждую дозу антитоксина). Животные, которым ввели смесь, где произошла нейтрализация токсина, остаются живыми. Наименьшее количество сыворотки, нейтрализовавшее токсин, принимается за единицу активности антитоксической сыворотки (АЕ)
Дата добавления: 2017-02-25; просмотров: 185 | Нарушение авторских прав
Похожая информация:
Поиск на сайте:
Тема №15. Метод флуоресцирующих антител (МФА). Реакция нейтрализации (РН).
Цель занятия: изучить серологические реакции (реакцию нейтрализации), метод флуоресцирующих антител, технику выполнения и учет результатов
Материалы и оборудование: сыворотка крови, штатив с пробирками, фиксаторы.
Метод флуоресцирующих антител (МФА).
Возможности данного метода обусловлены специфичностью первой фазы серологических реакций с высокой чувствительностью люминесцентного анализа. Для осуществления МФА необходимо иметь высокоспецифические иммунные люминесцирующие сыворотки. Известно, что в различных серологических реакциях, используемых в микробиологической практике, участвуют преимущественно три компонента: бактерийный антиген, антитело и комплемент. Все три компонента, по сути, являются антигенами, и против каждого из них могут быть получены иммунные сыворотки и, соответственно, люминесцирующие антитела. В зависимости от того, какого типа люминесцирующую сыворотку используют (против бактерийного антигена, антибактериальных антител, комплемента), различают три основных варианта метода флуоресцирующих антител: прямой (1) и непрямой (2) варианты и модификация непрямого варианта с использованием комплемента. Иммунологическая реакция между антигеном и антителом осуществляется в этих модификациях непосредственно на предметном стекле. Для фиксации микроорганизмов применяют органические растворители: ацетон, этанол, метанол, диоксан, а также обычные фиксаторы, используемые в микробиологической практике: формалин, смесь Никифорова, жидкость Карнуа и др.
Прямой вариант. На готовый препарат наносят специфическую люминесцирующую сыворотку на определенное время, затем излишек сыворотки сливают, препарат промывают и просматривают в люминесцентном микроскопе. Этот метод применяют для обнаружения бактерий в патологическом материале, объектах внешней среды, а также для идентификации возбудителей заболеваний в культурах.
Непрямой (двухступенчатый) вариант. На первом этапе происходит специфическое соединение антигена с соответствующим антителом немеченой сыворотки. На втором этапе специфическое немеченое антитело связывается с антивидовым люминесцирующим антителом, содержащимся в сыворотке животного, иммунизированного глобулинами (или цельной сывороткой крови) того вида животных, от которых была использована иммунная сыворотка.
Непрямой антикомплементарный (трехступенчатый) вариант. Первый этап: образование комплекса антиген — немеченое антитело. Второй этап: наслаивание нормальной сыворотки, содержащей комплемент.
Зачем нам нужен контроль для иммунофлуоресценции?
При иммунофлуоресценции красочные изображения настолько убедительны, что трудно представить, что содержащаяся в них информация может быть неправильной. Однако опытные ученые знают, что для того, чтобы доверять окрашиванию, вам нужны средства контроля, показывающие, что оно является специфическим. Например, чтобы знать, что окрашивание является реальным, а не возникло из-за аутофлуоресценции или неспецифического окрашивания, вам нужно не включать первичные антитела или изотипические контроли в свой эксперимент. Включение элементов контроля упрощает интерпретацию данных и помогает сузить проблему для устранения неполадок, например, когда вы не получаете сигнал.
Что могут рассказать различные контроли для иммунофлюоресценции?
Тип используемых иммунофлуоресцентных контролей будет зависеть от цели вашего иммунофлуоресцентного эксперимента. Для примера, если вы пытаетесь проверить линии Нокаут клеток, важно установить специфичность антитела. Наиболее часто используемые контроли включают контроль, чтобы показать специфическое связывание антитела (без первичного контроля), положительный контроль и отсутствие вторичного контроля антител, чтобы понять фоновый сигнал аутофлуоресценции. Я перечислил пять контролей, и каждый из них дает вам различную информацию для подтверждения вашего окрашивания
Положительный контроль
Это один из контролей иммунофлуоресценции, который вы всегда должны использовать в своих экспериментах, так как это важно для определения того, что что-то пошло не так во время окрашивания. Положительным контролем может быть любая ткань или клетки, в которых, представляющий интерес белок экспрессируется в изобилии (или если у вас избыточная экспрессия белка посредством трансфекции)
Если вы не видите окрашивания в положительном контроле, вы знаете, что что-то пошло не так.
Отсутствие первичного контроля антител
Инкубация образца с буфером для разведения антител без первичного антитела покажет, является ли наблюдаемый сигнал следствием неспецифического связывания вторичного антитела в образце ткани или клетки. Иногда вторичные антитела образуют агрегаты и могут рассматриваться как остатки в образце. Это может произойти из-за неправильных условий хранения. Поэтому всегда храните ваши антитела в соответствии с указаниями производителя, и рекомендуется хранить их в меньших аликвотах, чтобы избежать деградации от частых циклов замораживания-оттаивания.
Обратитесь к поставщику, чтобы определить, предварительно ли абсорбируются ваши вторичные антитела. Предварительная адсорбция является дополнительной стадией обработки, где вторичные антитела пропускаются через колонку, содержащую иммобилизованные сывороточные белки из потенциально перекрестно реагирующих веществ. Использование предварительно адсорбированных вторичных антител снижает риск перекрестной реактивности с неспецифическими мишенями.
Контроль поглощения
Это контроль, в котором вы инкубируете свой образец с истощенным иммунитетом первичными антителами. Он демонстрирует специфичность вашего первичного антитела, и вы не должны видеть сигнала от истощенного иммунитета первичного антитела. Плохо реагирующие антитела могут быть получены путем инкубации в течение ночи антитела при 4 O С с избытком иммуногена. Хотя это настоятельно рекомендуется, этот контроль не так популярен из-за ограничений в получении очищенного антигена/иммуногенов. Этот контроль более надежен, когда иммуноген представляет собой пептид, а не белок.
Контроль изотипа
Инкубация образца с неиммунным антителом того же изотипа (например, IgG 1 , IgG 2A , IgM) и в той же концентрации, что и у вашего основного антитела. Этот контроль показываетт, что наблюдаемое окрашивание не вызвано неспецифическими взаимодействиями первичного антитела. Любое окрашивание фона, которое вы наблюдаете с помощью этого элемента управления, должно быть минимальным и отличным от вашего конкретного окрашивания. Этот контроль полезен при работе с первичными моноклональными антителами.
Отсутствие вторичного контроля антител
Образцы, такие как мозг, легкие и толстая кишка (богатые эластином, коллагеном и липофусцином), имеют высокую аутофлуоресценцию. Никакие вторичные контрольные антитела не помогают определить, происходит ли наблюдаемая флуоресценция от фоновой аутофлуоресценции. Если вы обнаружите, что у вас появляется аутофлуоресценция, не беспокойтесь — есть способы, которые вы можете применить, чтобы ее уменьшить.
3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод ферментативного получения ампликонов (большого количества копий) исследуемых фрагментов ДНК путем повторных циклов репликации и денатурации (разделения цепи ДНК на отдельные нити); при этом происходит копирование только исследуемого участка ДНК (при условии его присутствия в данном образце), поскольку только этот участок соответствует заданным условиям.
Метод ПЦР идеально подходит для обнаружения микроорганизмов, трудно визуализирующихся, медленно растущих или сложных в культивировании. ПЦР является наиболее предпочтительным методом для диагностики заболевания в острый период. Основным лимитирующим фактором при использовании ПЦР является содержание в исследуемой пробе достаточного количества материала (нуклеиновой кислоты возбудителя). Для многих возбудителей известно, что их количество в крови меняется с течением времени; таким образом, в какой-то момент времени ПЦР может показать ложноотрицательный результат у инфицированного пациента
Таким образом, для врача крайне важно знать тропность возбудителя к тканям организма и отправлять на исследование тот материал, в котором вероятность обнаружения возбудителя наиболее высока (например, мочу – при диагностике лептоспироза, плаценту или пунктат семенников при подозрении на бруцеллез, синовиальную жидкость — при исследовании на боррелиоз).
К техническим недостаткам этого метода можно отнести возможность ложноотрицательных результатов из-за присутствия ингибиторов реакции в пробе, а также возможность ложноположительных результатов вследствие контаминации. Кроме того, данный метод не всегда подходит для оценки эффективности лечения, поскольку ПЦР выявляет как живые микроорганизмы, так и их «останки».
Сущность и технология
Сущность иммунофлуоресцентного метода состоит в визуализации антигенов специфичными антителами (связка «антиген-антитело») при помощи флуоресцентных маркеров.
Образцами для проведения иммунофлуоресцентного анализа являются клеточные суспензии (культуры бактерий, вирусов, клеток, микоплазм, риккетсий), образцы костного мозга, крови, тонких срезов ткани и альвеолярных смывов.
Оценка и исследование могут осуществляться вручную с помощью флуоресцентного микроскопа или в автоматическом режиме с применением проточного цитометра, а также микрочипового цитометра. Кроме этого, применяются конфокальный микроскоп и флуоресцентный роботизированный микроскоп (также в соединении с проточным цитометром) одновременно с программным обеспечением для обработки изображений. С помощью существующих на данный момент автоматизированных технологий можно анализировать до пятидесяти разных антигенов в одном образце с применением разнообразных флуоресцентных маркеров в рамках цитометрии и высокоинформативной микроскопии. Примерно до двадцати пяти антигенов одновременно можно исследовать при помощи конфокальной микроскопии или же проточной цитометрии.
Сфера применения
Иммунофлуоресцентный анализ имеет ключевое значение для лечения и ранней диагностики онкозаболеваний (онкогематология, иммуногистохимия), диагностике инфекционных болезней (к примеру, выявление клеток CD4+ при ВИЧ-инфекции, вирусов простого герпеса, цитомегаловируса), а также наследственных синдромов и заболеваний, передающихся половым путем (хламидиоз, уреаплазмоз). Кроме этого, иммунофлуоресцентный анализ применяется с целью обнаружения бактерий, которые с трудом поддаются культивированию (напр., Legionella pneumophila, вызывающая пневмонию).
| Методы диагностики в гинекологии | |
|---|---|
| Аппаратные методы | Видеокольпоскопия • Вульвоскопия • Гистероскопия • Гистеросальпингография • Кольпомикроскопия • Кольпоскопия • УЗИ • Хромокольпоскопия • Шиллер-тест • Эхогистеросальпингография |
| Лабораторные методы | MAR-тест • NASBA тест • Дот-гибридизация • Иммуноферментный анализ • Иммунофлуоресцентный анализ • ПАП-тест • ПЦР-диагностика |
| Методы диагностики в урологии | |
|---|---|
| Аппаратные методы | Биотезиометрия • Допплерография • ТРУЗИ • Ультразвуковая диагностика • Уретрография • Уретроскопия • Урофлоуметрия • Цистоскопия |
| Лабораторные методы | MAR-тест • NASBA тест • Дот-гибридизация • Иммуноферментный анализ • Иммунофлуоресцентный анализ • ПЦР-диагностика • Спермограмма |
| Методы диагностики инфекций |
|---|
| ПЦР-диагностика • Иммуноферментный анализ • Дот-гибридизация • Иммунофлуоресцентный анализ • NASBA тестЗППП • Простатит • Воспалительные заболевания |
2. Световая микроскопия
1) Микроскопия фиксированных окрашенных препаратов
Является наиболее доступным и потому распространенным методом диагностики инфекционных (особенно трансмиссивных) заболеваний в ветеринарной медицине. Основан на выявлении возбудителя в клиническом материале по характерной морфологии. Однако, несмотря на свою простоту и доступность, у этого метода есть свои недостатки.
Во-первых, у метода световой микроскопии достаточно ограниченная чувствительность. При незначительном количестве возбудителей в материале результат микроскопии может быть отрицательным.
Во-вторых, необходимо тщательное приготовление и окраска мазков для минимизации возможных артефактов.
В-третьих, лаборанту или врачу, интерпретирующему мазок, требуется достаточный опыт и хорошее знание морфологии как клеток тканей, так и возбудителей и умение отличать последних от возможных рефракционных артефактов или преципитатов красителя. И, в-четвертых, точное определение вида возбудителя при использовании только световой микроскопии возможно далеко не всегда. Поэтому световую микроскопию стараются дополнять другими методами диагностики, основанными на обнаружении специфических антител либо генетического материала возбудителя.
2)Темнопольная микроскопия
Вид оптической микроскопии, в которой контраст изображения увеличивают за счет регистрации только света, рассеянного изучаемым образцом. Как правило, используется для обнаружения спирохет — боррелий и лептоспир. Из-за необходимости наличия специального оборудования в рутинной ветеринарной практике применяется редко. Кроме того, с помощью темнопольной микроскопии невозможно определить видовую принадлежность возбудителя и его патогенность.