Химическая трансформация бактерий

История изучения[править | править код]

Впервые явление трансформации наблюдал в 1928 году Фредерик Гриффит, работавший с пневмококками (Streptococcus pneumoniae). Он обнаружил, что авирулентные штаммы, лишённые капсулы, могут получать нечто даже от мёртвых вирулентных клеток, имеющих капсулу, и в результате также становятся вирулентными. Через 16 лет Эвери, Маклеод и Маккарти показали, что этим самым агентом была ДНК, содержащая гены, необходимые для формирования капсулы. Они выделили ДНК из вирулентного штамма S. pneumoniae и показали, что введение одной только этой ДНК в клетки авирулентного штамма превращает их в болезнетворные. Результаты Эвери и коллег поначалу были встречены скептически, и окончательно они были признаны достоверными после описания явления генетического переноса Джошуа Ледербергом — конъюгации (в 1947 году) и трансдукции (в 1953 году).

В 1970 году было экспериментально показано, что клетки кишечной палочки Escherichia coli могут захватывать ДНК бактериофага λ без вспомогательного фага после обработки раствором хлорида кальция. Через два года была показана возможность захвата клетками в аналогичных условиях плазмидной ДНК. Так была изобретена химическая трансформация. В конце 1980-х годов для трансформации бактериальных клеток начали использовать электропорацию, которая оказалась во многих случаях эффективнее химической трансформации и была применима для большего числа штаммов.

Получение компетентных клеток

Вначале бактерии рассеиваются в чашку на агаризованную среду SOB (0,5% дрожжевой экстракт, 2% триптон, 2,5мМ KCl, 10мМ MgSO4, 10мМ NaCl, 10мМ MgCl2). Культура выдерживается в течение ночи при температуре 37°С. Из образовавшихся колоний бактерии отбирают 10-12 шт, диаметром 2-3мм и помещают в колбу емкостью 0,5-1,0л, куда наливают 40мл SOB. Емкость помещают в качалку, устанавливают скорость вращения 200-300 об/мин и при интенсивном встряхивании выращивают культуру при 37°С, пока оптическая плотность субстанции не достигнет OD600 = 0,6. В среднем для этого нужно 2-2,5ч.

Дальнейшие операции с бактериями проводятся на льду, для поддержания температуры на уровне 0°С. 30 мл субстанции отбирается в 50мл пробирку и выдерживается в течение 10-15 мин, после чего емкость помещается в универсальную медицинскую центрифугу. Сепарация производится на скорости 3000 об/мин при температуре до +4°С в течение 10 минут. Образовавшийся супернатант сливается, после чего центрифугирование повторяется при тех же параметрах в течение 20 секунд. Выделившаяся жидкость удаляется при помощи пипетки.

Полученный осадок смешивается с раствором, состоящим из 10мМ HEPES, 15мМ CaCl2, 55мМ MnCl2, 250мМ KCl (буфер ТВ) до образования суспензии и вновь выдерживается 10-15 минут на льду. Далее пробирка помещается в исследовательскую микроцентрифугу и повторяется процедура сепарирования: 10 минут при 3000 об/мин и t° +4C со слитием супернатанта и затем еще 20 секунд.

Микроцентрифуга K1015

После удаления остатков жидкости пипеткой к осадку добавляется 2 мл буфера ТВ, взбалтывается, после чего добавляется 70 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) для получения 3,5% раствора. Пробирка выдерживается 10-15 минут на льду. Затем проводится процедура центрифугирования при 3000 об/мин, температуре +4°С в течение 10 минут. После слива супернатанта остаток взбалтывается до суспензии и разливается по 100мкл в охлажденные пробирки емкостью 1,7мл. Полученные «кальциевые клетки» используются сразу или замораживаются в жидком азоте.

Значение[править | править код]

Схема искусственной трансформации

В естественных условиях трансформация даёт возможность бактериям получить извне гены, которые могут помочь адаптироваться к данным условиям. Таким образом, трансформация является одним из механизмов горизонтального переноса генов, наряду с конъюгацией (обменом клетками генетическим материалом при физическом контакте), и трансдукции, при которой фрагмент ДНК переносится фагом. Так как компетентность может вызываться повреждениями ДНК и часто происходит под действием агентов, вносящих повреждения в ДНК (например, у Helicobacter pylori трансформацию индуцирует антибиотик ципрофлоксацин, стимулирующий образование двуцепочечных разрывов), то трансформация может служить адаптивным механизмом, способствующим репарации ДНК. Получая фрагмент ДНК извне (особенно от бактерии того же вида), бактерия может использовать его в качестве матрицы для репарации повреждений путём гомологичной рекомбинации.

Трансформация стала рутинным методом молекулярной биологии для наработки большого количества требуемой плазмиды. Чтобы искусственно ввести клетки в состояние компетентности, существует два основных подхода: электропорация, при которой клетки поглощают ДНК после кратковременно приложенного напряжения, и химическая трансформация, при которой на клетки действуют разнообразными солями двухвалентных ионов, например, хлоридом кальция.

Механизм[править | править код]

К трансформации способны многие бактерии, например, Streptococcus, Haemophilus, Bacillus, актиномицеты, цианобактерии и другие бактерии. Так, антигенная вариация, наблюдаемая у возбудителя гонореи Neisseria gonorrhoeae, обеспечивается за счёт трансформации, при которой клетки передают друг другу гены различных вариантов пилей, за счёт которых прикрепляются к клеткам организма-хозяина. В нормальном состоянии проникновению крупных молекул ДНК внутрь бактериальных клеток мешают плотные покровы, поэтому, чтобы быть способной к трансформации, клетка должна войти в так называемое состояние компетентности. В естественных условиях компетентность приобретает часть культуры в логарифмической фазе роста под действием некоторых белков (факторов компетентности), действующих через двухкомпонентную систему. Хлорамфеникол, блокирующий синтез белка, не даёт образовываться и компетентным клеткам. Возможно также, что свою роль в развитие компетентности вносит плотность бактериальной культуры, поскольку при этом повышается концентрация факторов компетентности. У Streptococcus mutans и у других видов рода Streptococcus трансформация часто происходит при формировании биоплёнок. У Bacillus subtilis некоторые гены, вовлечённые в развитие компетентности, также задействованы в споруляции. Развитие компетентности в лог-фазе обусловлено нехваткой питательных веществ и накоплением значительного количества факторов компетентности. Трансформацию могут провоцировать бактериофаги, вызывающие выход ДНК из погибающих клеток, а также повреждения бактериальной ДНК. Приобретение компетентности — чрезвычайно сложный физиологический процесс, у Bacillus subtilis он требует экспрессии около 40 генов.

Сначала компетентные клетки связывают ДНК своей поверхностью с помощью особых рецепторов, причём линейными фрагментами клетка трансформируется гораздо легче, чем кольцевыми. ДНК расщепляется нуклеазами до фрагментов с массой до 4—5 миллионов Да, причём в клетку поступает лишь одна из двух цепей фрагментов. Некоторые бактерии, такие как пневмококки и Bacillus subtilis, могут поглощать ДНК из разнообразных источников, а другие, такие как Haemophilus, могут поглощать только ДНК клеток своего вида. Фрагменты, имеющие массу менее 500 кДа, в клетку не попадают.

После попадания в клетку одноцепочечный фрагмент встраивается в геномную ДНК клетки-реципиента. Трансформация длится от 10 до 30 минут и у разных бактерий происходит с частотой около 1 %.