Реакция связывания комплемента (рск)

Эта реакция используется для того, чтобы обнаружить в сыворотке крови больного антитела к инфекционному агенту, а также с целью идентифицировать возбудителя по его антигенной структуре.

До этого момента мы описывали простые серологические реакции. РСК считается сложной реакцией, так как в ней взаимодействуют не два, а три элемента: антитело, антиген и комплемент. Суть ее заключается в том, что взаимодействие между антителом и антигеном происходит только в присутствии белков комплимента, которые адсорбируются на поверхности образовавшегося комплекса АГ-АТ.

Сами антигены, после присоединения комплемента, подвергаются существенным изменениям, которые и показывают качество проведенной реакции. Это может быть лизис, гемолиз, иммобилизация, бактерицидное или бактериостатическое действие.

Сама реакция происходит в две фазы:

Образование комплекса антиген-антитело, которое визуально не заметно исследователю.
Изменение антигена под действием комплемента. Эта фазу чаще всего можно отследить невооруженным глазом. Если же визуально реакции не видно, то используют дополнительную индикаторную систему, позволяющую выявить изменения.

Реакция лизиса (РЛ)

Иммунная сыворотка, которая попадает в организм больного, обладает, кроме своей основной функции пассивного иммунитета, еще и лизирующими свойствами. Она способна растворять микробные агенты, клеточные чужеродные элементы и вирусы, поступающие в организм больного. В зависимости от специфичности входящих в состав сыворотки антител выделяют бактериолизины, цитолизины, спирохетолизины, гемолизины и другие.

Эти специфические антитела называются «комплемент». Он содержится практически во всех жидкостях тела человека, имеет сложную белковую структуру и крайне чувствителен к повышению температуры, встряхиванию, действию кислот и прямых солнечных лучей. Но в высушенном состоянии способен сохранять свои лизирующие свойства до полугода.

Существуют такие виды серологических реакций этого типа:

Бактериолиз;

Гемолиз.

Бактериолиз проводят, используя сыворотку крови пациента и специфическую иммунную сыворотку с живыми микробами. Если в крови присутствует достаточное количество комплемента, то исследователь увидит лизис бактерий, и реакция будет считаться положительной.

Вторая серологическая реакция крови заключается в том, что взвесь эритроцитов больного обрабатывают сывороткой, содержащей гемолизины, которые активизируются только в присутствии определенного комплимента. Если таковой имеется, то лаборант наблюдает растворение красных клеток крови. Данная реакция широко используется в современной медицине для определения титра комплемента (то есть его наименьшего количества, провоцирующего лизис эритроцитов) в сыворотке крови и для постановки анализа на связывание комплемента. Именно этим способом проводится серологическая реакция на сифилис —

Сложные реакции иммунодиагностики. Реакция связывания комплемента ( РСК ). Феномен лаковой крови. Этапы, техника реакции связывания комплемента.

Реакция связывания комплемента (РСК) предложена Ж. Борде и О. Жангу. Реакция включает две фазы (рис. 10-18).

Рис. 10-18. Реакция связывания комплемента. А — отрицательная реакция. Специфические в отношении исследуемого Аг AT отсутствуют. Образования иммунных комплексов, связывающих комплемент, не происходит. Молекулы комплемента сорбируются на клетках-мишенях (эритроцитах), вызывая их лизис. Б — положительная реакция. Имеющиеся в сыворотке AT специфически связывают исследуемый Аг, образуя иммунный комплекс. Последний связывает комплемент, и лизиса эритроцитов не наблюдают.

В фазе I (специфической) реакции связывания комплемента ( РСК ) искомый Аг (или AT) реагирует с диагностической антисывороткой (или Аг-диагностикумом) и комплементом. Образующийся комплекс Аг-АТ связывает комплемент.

В фазе II (индикаторной) реакции связывания комплемента ( РСК ) определяют наличие свободного комплемента внесением в реакционную среду гемолитической системы — эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей AT к ним. Если Аг и AT не соответствуют друг другу и не образуют иммунных комплексов, то связывания комплемента не происходит. В этом . случае свободный комплемент взаимодействует с компонентами гемолитической системы, фиксируясь на комплексе эритроцит-антиэритроцита рное AT. Следствие этого — гемолиз индикаторных клеток (феномен «лаковой крови») — реакцию считают отрицательной.

Если в фазе I реакции связывания комплемента ( РСК ) AT и Аг соответствуют друг другу, то образующиеся иммунные комплексы связывают комплемент, разрушения эритроцитов после внесения гемолитической системы не наблюдают и реакцию считают положительной. Основные недостатки РСК: сложность (включает 5 компонентов), лабильность некоторых компонентов и возможные антикомплементарные свойства у сывороток и Аг. Тем не менее РСК применяют в диагностике многих заболеваний, например при диагностике сифилиса (реакция Вассерманна).

— Также рекомендуем «Реакция радиального гемолиза в геле. Реакция локального гемолиза в геле. Унитиоловая проба.»

Иммуноферментный анализ.

Иммуноферментный анализ как метод серологической диагностики

ИФА основан на выявлении комплексов Аг-Ат при помощи маркирования одного из компонентов. В качестве метки используются различные ферменты, которые в результате ферментативной реакции образуют окрашивание. Существуют разнообразные методы ИФА, их можно классифицировать как гомогенные и гетерогенные методы.

Гомогенные означают, что все этапы реакции происходят в растворе.

Гетерогенные методы включают разделение на фазы с использованием твёрдого носителя.

Гомогенно-гетерогенные способы основываются на том, что комплексы Аг-Ат формируются в растворе, а затем для разделения используется твёрдая фаза.

Принцип «сэндвич»-метода

Существует множество вариаций методов ИФА, некоторые из них представлены ниже.

Сэндвич-метод. К иммобилизованным Ат добавляется раствор с Аг, после образования комплексов носитель отмывают от лишних компонентов и добавляют маркированные Ат. В результате, Аг оказываются зажатыми иммобилизованными и мечеными Ат, откуда и произошло название метода.
Неконкурентный непрямой ИФА. К иммобилизованным Аг присоединяют исследуемую сыворотку с Ат. Когда образуются комплексы, лишние Ат смывают и добавляют маркированные Ат, способные связаться с прикреплёнными к поверхностям лунок иммунными комплексами.
Конкурентный прямой ИФА. К иммобилизованным Аг вносят исследуемую сыворотку и конъюгат, содержащий маркированные Ат. Формируются комплексы Аг-Ат нескольких видов: с мечеными Ат и с немаркированными Ат, которые вступают между собой в конкуренцию за связь с Аг.

Подготовка к анализу

Для того, что бы правильно подготовиться к забору крови на серологические исследования, достаточно соблюдать обычные правила перед сдачей крови.

Необходимо отказаться от плотного ужина на ночь, допускается лишь легкий перекус. Это условие следует обязательно выполнить для избежания хилёза, или повышенного содержания липидов в исследуемой сыворотке. Многие анализы при хилёзной крови выполнить невозможно по техническим причинам.

Накануне исследования следует ограничить табакокурение, полностью исключить алкоголь. Привычные ранее физические нагрузки убирать не обязательно.

Утром в процедурный кабинет следует явиться строго натощак, допускается лишь выпить стакан воды.

Забор крови осуществляется в лаборатории или в процедурном кабинете. Посредством прокола сгиба локтевой вены медсестра набирает венозную кровь в вакуумную пробирку (или в шприц). Маркированная пробирка доставляется в вирусологическую или в бактериологическую лабораторию, где и проводится исследование. Результат, как правило, готов через 5-7 рабочих дней.

Методы диагностики

Чаще всего в лабораториях серологическая диагностика представлена следующими иммунохимическими серореакциями:

реакция иммунофлюоресценции (РИФ);
иммуноферментный анализ (ИФА);
реакция непрямой гемагглютинации (РНГА);
реакция связывания комплемента (РСК).

Эти виды исследования относятся к сложным серореакциям и обладают значительными преимуществами перед остальными. Они проводятся крайне быстро, имеют высокую точность диагностики болезней и не требуют длительной подготовки: от пациента требуется только сдать анализ венозной крови.

Иммунофлюоресцентная реакция РИФ

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ), или анализ Кунса – метод экспресс-обнаружения антигенов патогенного агента в биоматериале пациента. Для проведения РИФ используется специальный краситель – флюорохром, способный светиться под люминесцентным микробиологическим микроскопом. Флюорохром добавляют в диагностическую сыворотку со строгим соблюдением концентрации, иначе реакция может показать ложные результаты. Иммунофлюоресцентная реакция бывает двух видов: прямая и непрямая.

Прямая реакция Кунса выявляет только антигены возбудителя. Для их определения в биоматериал добавляют диагностическую сыворотку, состоящую из антител и флюорохрома. Антигены, находящиеся на клеточной стенке возбудителя, связываются с окрашенными антителами. Врач лабораторной реакции рассматривает предметное стекло под микроскопом и видит ярко-зеленое свечение. Типичным примером такой реакции является выявление хламидий, контрастированных синькой Эванса.

Непрямая РИФ (РНИФ) определяет антигенно-антительные комплексы. Для этого врач последовательно добавляет в образец сначала немеченые иммуноглобулины, чтобы они связались с антигенами. Затем к образованным иммунным комплексам добавляется новая сыворотка, содержащая уже меченные красителем антитела к недавно образовавшимся комплексам. Наиболее часто прямая реакция используется для диагностики вирусных болезней.

Единственным недостатком данных реакций является некоторая степень субъективизма при учете результатов: одна и та же интенсивность свечения иногда расценивается врачами по-разному, что в итоге приводит к ложным данным лабораторного обследования.

Реакция непрямой гемагглютинации РНГА

Для проведения исследования используются красные клетки крови – эритроциты, на поверхности которых расположены антигены или антитела. Сыворотка носит название антигенного или антительного эритроцитарного диагностикума. Диагностикум добавляют к исследуемой крови, затем наблюдают за реакцией. При присоединении этих эритроцитов к антигенам или иммуноглобулином крови образуются комплексы, а красные кровяные клетки начинают выпадать в осадок. При отрицательном анализе эритроциты скапливаются в виде небольшого пятна в виде пуговицы. Если же на дне пробирки или планшетки образовался осадок с фестончатыми краями в виде зонтика, то реакция считается положительной.

Сложность в проведении этого серологического теста заключается в необходимости точного приготовления эритроцитарного диагностикума и строгого соблюдения концентраций используемых компонентов.

Иммуноферментный анализ ИФА

Метод иммуноферментного анализа считается самой точной, специфичной и чувствительной серореакцией. Учет результатов ИФА автоматизирован, а человеческий фактор и субъективная оценка данных исключена. Точность результата достигает 98%, а при повторном исследовании – 100%. ИФА используется для диагностики инфекций, передающихся половым путем, ВИЧ, вирусных гепатитов A, B, C, D, E, TORCH-инфекций и множества других заболеваний.

Существует более десяти модификаций данного анализа (прямой, непрямой, неконкурентный, твердофазный и т. д.), но все они имеют особые, характерные особенности диагностики, но схожий принцип проведения. Фазы иммуноферментных серологических реакций включают в себя создание комплекса антиген-антитело, к которому добавляют ферменты, играющие роль метки. Затем исследуемый материал располагают на специальный планшет, помещают в автоматизированную систему и начинают поиск комплексов, меченых радионуклидами. Анализатор выявляет святящиеся метки, измеряет оптическую плотность и степень свечения иммунных клеток, а затем выдает результат анализа.

Показания к исследованию

Положительная RPR может выявляться уже через семь – десять суток после появления у пациента первичного сифилитического шанкра или через три-пять недель после заражения.

Реакция Вассермана обладает чувствительностью от 70 до 80% при диагностике первичного сифилиса и практически стопроцентной чувствительностью при раннем латентном и вторичном сифилисе.

После наступления вторичной стадии, титры начинаю снижаться. Следует учитывать, что около тридцати процентов позднего сифилиса может быть ложноотрицательным по RPR.

Поэтому проведение трепонемных тестов, с целью уточнения диагноза, является обязательным.

Однако, реакция Вассермана (RPR) может эффективно применяться для контроля проводимого лечения сифилиса.

Основными показаниями к проведению анализа служат:

случайные половые связи;
употребление наркотиков;
контакт с больным сифилисом;
подозрение на сифилис (наиболее специфично появление твердого шанкра);
контроль лечения сифилиса;
беременность, донорство, работа в медицинских учреждениях (входит в список стандартных обследований);
расстройства психики и поражения нервной системы (нейросифилис).

Также, обязательному обследованию подлежат дети, рожденные от инфицированных матерей.

Анализ при беременности

Классическая реакция Вассермана при беременности часто давала ложноположительные результаты. Новые тесты (RРR) реже дают подобные погрешности. Однако, учитывая, что некоторые заболевания также могут стать причиной возникновения ложноположительных результатов, при получении положительного ответа следует выполнить ИФА или РПГА.

Реакция непрямой агглютинации (РПГА)

Для ее постановки используют очищенные бараньи эритроциты и красные кровяные тельца человека, предварительно обработанные антителами или антигенами (это зависит от того, что именно лаборант хочет найти). В некоторых случаях человеческие эритроциты обрабатывают иммуноглобулинами. Серологические реакции эритроцитов считаются состоявшимися, если произошло их осаждение на дно пробирки. О положительной реакции можно говорить, когда клетки располагаются в виде перевернутого зонтика, занимая все дно. Отрицательная реакция засчитывается, если эритроциты осели столбиком или в виде пуговки в центре дна.

Как проводится процедура

Кровь на реакцию Вассермана проводится только натощак, это важное условие. Последний прием пищи до забора должен быть не позднее, чем за 6 часов

Сотрудник, который проводит манипуляции, садит клиента на стул или укладывает на кушетку. Для анализа требуется 8-10 мл крови ил локтевой вены. Если исследование проводится маленькому ребенку, то взять материал могут из яремной или черепной вены.

Сколько дней делается анализ крови на RW

Есть два этапа проведения исследования материала. Экспресс-тест Вассермана будет готов через 2 часа, но он сможет только подтвердить или опровергнуть наличие антител сифилиса у пациента. Чтобы получить количественную информацию по состоянию крови, концентрацию антител к трепонеме, нужно от 1 до 7 суток. Продолжительность проведения анализа и расшифровки зависит от лаборатории, количества текущих анализов.

Методы диагностики сифилиса

Тесты должны выявить основного возбудителя болезни – treponema pallidum она же бледная трепонема. Для этого натощак делают забор крови для проведения серологического анализа. Такое исследование принято считать основным видом лабораторной диагностики для выявления сифилиса. Самыми распространёнными методами исследования являются:

анализ крови на РВ (RW) – анализ Вассермана;
РПГА – реакция пассивной гемагглютинации;
ИФА – иммуноферментный анализ крови;
РИФ – реакция иммунофлюоресценции;
RPR – реакция микропреципитации с кардиолипиновым антигеном;
РИБТ – реакция иммобилизации бледных трепонем.

Ложноположительная реакция Вассермана. Причины

Важно. При проведении первичного обследования следует учитывать, что нетрепонемные тесты не обладают специфичностью

Это связано с тем, что антитела к кардиолипину могут появляться не только при инфицировании сифилисом.

Чаще всего ложноположительная реакция Вассермана выявляется у пациентов с:

СД (сахарный диабет);
туберкулезом;
злокачественными новообразованиями;
аутоиммунными патологиями (системное поражение соединительной ткани);
вирусными гепатитами;
энтеровирусной инфекцией;
тяжелой пневмонией;
инфекционным мононуклеозом;
скарлатиной;
малярией;
подагрой;
алкоголизмом;
антифосфолипидным синдромом (при исключенном до этого (при помощи трепонемного теста) сифилисе, RW может применяться с целью подтверждения этого синдрома);
эозинофильным инфильтратом в легких.

Также, ложноположительные результаты возможны у детей на седьмой-десятый день жизни, беременных, пациентов после вакцинации и носителей несифилитических трепонем. У лиц, принимающих наркотические средства, реакция Вассермана также будет ложноположительной.

Еще следует учитывать, что при очень высоком титре сифилитических антител могут диагностироваться ложноотрицательные результаты.

В связи с этим, RW следует проводить в комплексе, с использованием специфических трепонемных тестов. Чаще всего применяют ИФА или РПГA к Trepоnemа pаllidum IgG/IgМ,

Современное понимание реакции Вассермана

В современных лабораториях «классическая» реакция Вассермана считается устаревшей и не используется. Однако в листе ответов и бланке назначений все равно часто пишут RW.

В настоящее время под этим термином подразумевают модифицированные современные RW.

Наиболее распространенный аналог реакции Вассермана – это RРR (неспецифический антифосфолипидный тест). Он также относится к нетрепонемным тестам (то есть не обладает высокой специфичностью), однако более чувствителен и имеет меньший риск ложноположительных результатов, чем классическая реакция Вассермана.

Тест RРR является скрининговым исследованием, позволяющим обнаружить антитела (IgG и IgM) к кардиолипину.

Для проведения анализа, также, как и для классической реакции Вассермана, применяется венозная кровь.

Анализ желательно сдавать натощак. За час до взятия крови исключается курение. Несмотря на то, что риск ложноположительных результатов при RРR ниже, чем при RW, в идеале, предпочтительно не употреблять накануне анализа спиртные напитки и жирную пищу.

Сущность методов, их преимущества и недостатки

Существует несколько серологических методов диагностики, но принцип их применения сводится к одному – к реакции “антиген-антитело”. Это основывается на том, что антиген инфекционного возбудителя, если он есть в крови обследуемого, обязательно даст специфическую реакцию на соответствующее антитело в контрольной (диагностической) сыворотке крови. И наоборот, антитело, если оно есть в крови обследуемого, даст реакцию на контрольный антиген, содержащийся в диагностикуме лаборанта.

Серологические анализы имеют существенные достоинства в диагностике многих заболеваний, а именно:

доступность и охват исследованиями широких масс населения,
относительная простота методик,
умеренная стоимость большинства исследований,
быстрота выполнения анализа (три-пять рабочих дней).

Тем не менее, у серологических исследований имеются и некоторые недостатки, например, необходимость инвазивного вмешательства при заборе крови, а что существеннее – в некоторых случаях невозможность отличить уже перенесенную инфекцию от текущей болезни.

Итак, из серологических исследований крови выделяют следующие методики:

Реакция агглютинации (РА), чаще используется реакция не прямой, или пассивной агглютинации (РПГА). Основывается на поиске антигена (в данном случае, агглютиногена) в биологической жидкости пациента, или на поиске антител (агглютининов) в исследуемой сыворотке крови. Может применяться не только в диагностике инфекционных заболеваний, но и в определении ревматоидного фактора (РФ), а также в определении группы крови.
Реакция связывания комплемента (РСК).
Иммуноферментный анализ (ИФА).
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ).

РПГА

РПГА выполняется следующим образом. Исследуется сыворотка крови пациента, в которой осуществляется поиск антигена или антител с помощью антительного или антигенного диагностикума, соответственно. При этом контрольные антитела или контрольные антигены фиксируются на эритроцитах барана или на частичках латекса размером не более 5-ти мкм. В том случае, если в крови выявляются искомые антитела или антигены, с контрольным диагностикумом происходит реакция агглютинации (склеивания), которую можно оценить визуально по наличию хлопьев или комочков в прозрачной среде диагностикума.

РСК

Отличие РСК заключается в следующем. Для поиска антител в исследуемой сыворотке крови к тому или иному антигену используется диагностикум, содержащий не только эритроциты барана, но еще и свободный комплемент. Комплемент- это белковый комплекс, способный активировать мембраноатакующий компонент. Эритроциты же сенсибилизированы собственными к ним антителами, поэтому здесь два пути развития событий. Первый – если антитела, допустим, к возбудителю коклюша у пациента в крови циркулируют, то система комплемента будет направлена на ликвидацию этих только что образовавшихся комплексов “антиген-антитело”, а эритроциты барана останутся нетронутыми. Гемолиза эритроцитов барана не произойдет – диагностикум останется прозрачным, с небольшим осадком на дне из эритроцитов барана. РСК положительная (гемолиза нет).

И второй путь – антител к коклюшу в крови пациента нет, тогда системе комплемента придется связать комплекс “антиген-антитело” на эритроцитах барана. В этом случае будет гемолиз эритроцитов барана, визуально это выглядит, как прозрачная однородная красно-оранжевая лаковая кровь. РСК отрицательная (гемолиз есть).

ИФА

Для проведения ИФА используются те же самые диагностикумы, но меченые ферментами (щелочная фосфатаза, пероксидаза и др). Таким образом, на положительные комплексы “антиген – антитело” формируется реакция, результат которой с легкостью можно визуально оценить на специфических тест-системах. Преимущество ИФА в том, что результат готов уже через несколько дней, и даже часов – это экспресс-диагностика (чаще применяется при экспресс диагностике ВИЧ – инфекции).

РИФ

РИФ отличается от предыдущих методик тем, что в последнем случае антитела к определенным возбудителям помечаются флюоресцентными веществами. При рассмотрении исследуемых образцов ткани пациента, обработанных мечеными антителами, в люминисцентном микроскопе образуемые комплексы “антиген – антитело” светятся, значит, реакция положительная.

Иммунофлюорисцентный метод.

«Свечение» в темнопольном микроскопе

Данный метод основан на использовании Ат, меченных флуоресцентным веществом. Чаще всего в качестве метки используется флуоресцеинизотиоционат, обладающий зелёным свечением в лучах ультрафиолета. Результат анализа оценивается по степени яркости свечения. Может быть использован ручной метод определения при помощи люминесцентного микроскопа, оптического микроскопа с люминесцентной насадкой, а также автоматический способ с применением микрочипового цитомера, проточного цитомера либо роботизированного флуоресцентного микроскопа.

РИФ проводится прямым и непрямым методом. Прямой способ означает непосредственное связывание сорбированного Аг с меченым Ат. Непрямой метод подразумевает использование немаркированных Ат для связки с Аг, а затем добавление меченых Ат, что позволяет избежать неспецифических реакций.

Методы проведения серологического исследования.

В серологии может применяться большое число методов

Все методики определения комплексов антиген-антитело (Аг-Ат) основываются на использовании известного Аг либо Ат в поиске неизвестного. Если необходимо обнаружить Аг, необходимы диагностические иммунные сыворотки с содержанием специфических Ат. Если целью СИ является выявление Ат, используются диагностикумы — взвеси, содержащие определённые Аг.

Серологические анализы могут отражать качественный либо количественный результат. При качественном исследовании итог может быть отрицательный или положительный, то есть искомый элемент либо обнаружен, либо нет. Количественный итог выражается в виде числового значения либо знаками «+» (обычно от одного до четырёх).

Непрямая гемагглютинация — один из методов диагностики

Методы серологических исследований:

Агглютинация. Связывание Ат с Аг с последующим формированием хлопьев либо осадка. Применяются прямые, непрямые, развёрнутые, ориентировочные реакции, позволяющие выявить антитела в сыворотке.
Гемагглютинация. Используются эритроциты с адсорбированными на них Аг либо Ат, которые склеиваются с соответствующими Ат и Аг. Образуемые комплексы выпадают в виде фестонного осадка.
Преципитация. Образование комплекса Аг-Ат с последующим осаждением в виде помутнения, именуемого преципитатом.
Коагглютинация. Выявление Аг при помощи Ат, адсорбированных на белке клеток стафилококка.
Торможение гемагглютинации. Ат иммунной сыворотки подавляют вирусные Аг, в итоге вирусы теряют способность склеиваться с эритроцитами.
Непрямая реакция Кумбса. Определяются Ат к поверхностным Аг эритроцитов.
Кольцепреципитация. Проводится на основе иммунной сыворотки с наслоением растворимого Аг.
Двойная радиальная иммунодиффузия. Реакция основана на диффундировании компонентов антисыворотки и Аг в лунках агара либо агарозы.
Реакция связывания комплемента. Связь Аг и Ат сопровождается адсорбцией комплемента, в качестве индикатора используются эритроциты барана и Ат к ним в составе гемолитической сыворотки.
Нейтрализация. Основана на нейтрализации вирусного агента антителами.
Реакции, основанные на маркировании Ат и Аг флуоресцентным либо ферментным составом — иммунофлюорисцентный (РИФ) и иммуноферментный (ИФА) методы.