Выделение вирусов из окружающей среды

Оборудование, химреактивы, конъюгаты и растворы

Для культивирования вируса РРСС применяли следующие культуры клеток: — первичную культуру альвеолярных макрофагов свиней АМС, которую получали от клинически здоровых поросят в возрасте 4-6 недель; — перевиваемую культуру клеток MARC-145 (клон клеток почки эмбриона макаки -резус МА-104), привезенную из США (National Animal Disease Center UIDA, Agricultural Research Service, Ames, Iowa, 50010, USA); — перевиваемую культуру клеток почки эмбриона макаки — резус МА-104; — перевиваемую культуру клеток почки зеленой африканской мартышки Vero и другие, полученные из коллекции культур клеток ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Культуры клеток в виде выращенного монослоя или суспензии клеток получали сначала из лаборатории болезни Марека и культивирования клеток (заведующая лабораторией д.вет.н. Ш.К. Куляшбекова), затем из отдела культивирования культур клеток (заведующий лабораторией к.б.н. Б.Л. Манин).

Возможность репродукции вируса РРСС исследовали на 9-11-дневных СПФ-куриных эмбрионах, полученных из лаборатории болезней птиц. Перевиваемую культуру клеток MARC-145 выращивали в стационарных условиях по следующей схеме: — культивирование в монослое клеток MARC-145 вели до конечной стадии ло гарифмической фазы роста; з — дезагрегация монослоя клеток осуществляли с помощью 15-20 см диспергирующей смеси, состоящей из 0.02% раствора версена и 0.25% раствора трипсина в соотношении 9:1. Данную смесь наносили на монослой клеток и выдерживали на контакте 15-20 минут при 37С в термостате; — отделение клеток монослоя от субстрата, для чего сливали диспергирую-щую смесь, вносили в клинский матрас 50 см питательной среды RS-3M или Игла и тщательно встряхивали до полной диссоциации клеток; — получение клеточной суспензии, для этого в клинский матрас добавляли от 200 до 300 см полной ростовой среды RS-3M или Игла, содержащей 10% сыворотки крови крупного рогатого скота и 0.3 мг/см3 глютамина. Затем подсчитывали количество клеток в 1 смъ в камере Горяева и ресуспендировали клетки в ростовой среде до посевной концентрации 150 тыс. кл/см ; — посев клеточной суспензии по 150 см? в специально подготовленные клин-ские матрасы.

Первичную культуру альвеолярных макрофагов свиней (АМС) получали по следующей схеме: -обескровливание животных, С этой целью клинически здоровых поросят-отъемышей в возрасте 4-6 недель, полученных из благополучных в отношении РРСС и других инфекций хозяйств, обескровливали, не допуская попадания крови в трахею; -изолирование легких. Отпрепарированные легкие помещали в стерильный сосуд с ФБР, содержащим антибиотики (гентамицин в дозе 0.8 мг/см3); — получение АМС. АМС вымывали из легких при помощи ФБР (рН 7,2) или питательной среды Игла, содержащей антибиотики (25 мкг/см3 канамицина, 0.0025 мг/см3 амфотерицина и 0.04 мг/см3 нистатина); — приготовление суспензии АМС. АМС трехкратно промывали в ФБР путем центрифугирования при 2000 об/мин. и удаления надосадка. Затем АМС ресуспендировали в питательной среде Игла, содержащей 10% фетальной сыворотки КРС, 0. мг/см глютамина и антибиотики (25 мкг/см канамицина, 0.0025 мг/см амфотерицина и 0.04 мг/см3 нистатина); — подсчет клеток проводили в камере Горяева по общей формуле для АМС и клеток MARC-145 и вычисляли их концентрацию в 1 см3 по формуле: axlQQQxn 0.9 , где а — среднее число АМС в приготовленной суспензии; 1000 — число мм3 в 1 см3; п — степень разведения суспензии; 0.9 — объем камеры Горяева в мм3; — посев суспензии АМС в матрасы или микропланшеты. Получали посев ную концентрацию АМС, разбавляя их ростовой питательной средой Игла, от 3 1060 кл/см3 (для посева в матрасы) до 6 1060 кл/см3 (для посева в микропланшеты); — культивирование АМС проводили в течение 18-20 часов при +37С в СОг инкубаторе с содержанием 5% С02.

В лабораторных опытах использовали свиней пород крупная белая и ландрас из благополучных по РРСС и другим инфекционным заболеваниям хозяйств: — поросят-сосунов разного возраста с массой тела 1.5-8 кг — 23 шт.; — подсвинков 2-4 мес. возраста с массой тела 15-30 кг — 146 шт.; — супоросных свиноматок с массой тела 100-120 кг — 2 шт.

Для изучения безвредности и иммуногенной активности вакцин кроме свиней использовали лабораторных животных: — кроликов пород советская шиншилла и серебристый с массой тела 2-2.5кг -175 шт.; — морских свинок двухцветных с массой тела 250-300 г — 40 шт.; — белых мышей беспородных с массой тела 18-2ІГ — 230 шт.