Иммунофлуоресцентный анализ

ИФА — иммуноферментный анализ и РПГА — реакция пассивной гемагглютинации

Иммуноферментный анализ (ИФА) и реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) – новые высокочувствительные и высокоспецифичные, удобные в постановке (с возможностью автоматизации), хорошо воспроизводимые, недорогие методы серологической диагностики сифилиса.
ИФА по механизму реакции, чувствительности и специфичности близок к РИФ. В обеих реакциях принимают участие одни и те же антитела. При ИФА для визуализации реакции антиген-антитело используют реакцию фермента (щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена) с субстратом, который при этом меняет свою окраску. Интенсивность окраски определяет позитивность реакции (от + до ++++). Благодаря автоматизации, этот тест можно применять для скрининга на сифилис больших групп обследуемых: беременных, доноров, больных психоневрологических и кардиологических стационаров и др. Возможна постановка ИФА с ликвором. В настоящее время планируется замена комплекса КСР на сочетание РМП и ИФА.

Результаты ИФА (как и РИФ) становятся положительными в первые дни первичного периода или в конце инкубации и остаются положительными во всех периодах.

При постановке ИФА возможно выявление суммарных антител и дифференцированное определение трепонемоспецифических IgM и IgG. IgM появляются в крови больных лишь в первые недели и месяцы болезни, а затем – исчезают. Поэтому, их выявление при ИФА свидетельствует о наличии ранних нелеченых форм сифилиса, раннего врожденного сифилиса, реинфекции. При выявлении IgG принципиальным является их количество, что отражается с помощью коэффициента позитивности (порядок величин этого показателя варьирует при применении разных тест-систем).

При РПГА в качестве антигена используются заформалиненные эритроциты барана, покрытые антигенами патогенных бледных трепонем. При добавлении к этим эритроцитам сыворотки, содержащей специфические антитела, происходит их агглютинация.

Результаты РПГА оценивают как реактивные, слабореактивные и нереактивные.

Помимо качественного исследования, во всех тест-системах предусмотрен количественный анализ с определением титра. Как и ИФА, РПГА проста в исполнении, не требует высокой квалификации персонала и специального оборудования, возможна ее автоматизация.

РПГА становится положительной уже в инкубационном периоде и может оставаться таковой спустя много лет после выздоровления (не может использоваться для контроля излеченности). По чувствительности и специфичности РПГА не уступает, а при поздних формах и врожденном сифилисе даже превосходит РИФ и РИБТ.

ЛПР при постановке ИФА и РПГА бывают редко и возможны при трепонематозах (фрамбезия, беджель, пинта), коллагенозах, циррозе печени, лимфосаркоме, инфекционном мононуклеозе, лепре, а также у беременных. Ложноотрицательные результаты возможны у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Разрабатываются новые высокоспецифичные методы серологической диагностики сифилиса, такие как иммуноблотинг, IgM-серология и др.

Август Пауль фон Вассерман (Wassermann, August von) (1866–1925), немецкий микробиолог и иммунолог.

Сущность и классификация метода[ | код]

Сущность метода заключается в визуализации антигена специфическими антителами с флуоресцентными маркерами. Метод конъюгации глобулинов с органическими флюорохромами разработан в 1942 году А. Кунсом (англ.)русск.. В настоящее время метод использует как антитела к различным антигенам, так и специфические красители к ДНК (к примеру DAPI), РНК (к примеру Sybr Green II), липидам и белкам.

В базовой МФА методике различают прямой метод, разработанный А. Кунсом и Мелвином Капланом, и непрямой, разработанный А. Кунсом и Уиллером в первоначальном варианте непрямого МФА с комплементом.

При прямом методе (пМФА) на исследуемый препарат или в суспензию клеток наносят раствор прямо меченых флюоресцентным красителем антител. Образование комплекса антиген-антитело обнаруживается флюоресцентным сигналом в виде свечения разной степени интенсивности и четкости.

При непрямом методе (нМФА) на препарат наносят антитела против искомых антигенов (т. н. «первые» антитела), а затем видоспецифичные «вторые» антитела против «первых» антител, что позволяет избежать неспецифических реакций. При этом только вторые антитела коньюгированны с флюоресцентным красителем. К примеру, если при исследовании в качестве «первых» антител используются мышиные антитела — mouse IgG, то в качестве «вторых» используются антивидовые anti-mouse IgG коньюгированные с флюоресцентным красителем. Комплекс антиген-антитело дает флюоресцентное окрашивание только после связывания со «вторым» антителом.

Непрямые методы требуют наличия только антиглобулиновых видовых сывороток с флюорохромами, но при этом необходимо большое количество тестовых контролей. При постановке прямым методом делается только один контроль, хотя в более ранних версиях метода требовалось множество моноспецифических сывороток. Долгое время недостатками прямых видов МФА являлись ограниченная чувствительность из-за наличия возможных перекрестных реакций между близкими по антигенному составу объектами и неспецифическая флуоресценция вследствие адсорбции флуоресцирующих глобулинов на различных элементах препарата. В настоящее время используются коммерческие стандартные конъюгаты, содержащие иммуноглобулины к исследуемым антигенам. Использование биоинженерных иммуноглобулинов и высокая степень очистки антител позволили практически свести на нет неспецифические реакции, что сделало возможным дальнейшее технологическое развитие метода.

Поскольку прямой метод в настоящее время позволяет избежать неспецифических реакций, автоматизированные методики преимущественно используют прямой метод иммунофлуоресценции.

Результаты ручной микроскопической оценки описываются в так называемых «крестах» (от одного + до четырёх ++++) — субъективная градация степени выраженности реакции глазом исследователя. В автоматизированных методах в качестве детектора используются фотоумножители или высокочувствительные флуоресцентные фотокамеры, что позволяет регистрировать сигнал с большой точностью и дает значение относительного уровня флюоресценции (relative fluorescence ratio) в широком диапазоне шкалы. Абсолютное значение высчитывается с помощью контролей или антигенов с известным постоянным содержанием в образце. При использовании автоматизированных методов обработка данных осуществляется специализированными программами для обработки изображений и анализа цитометрических данных.

Расшифровка анализа

Все серологические анализы крови на сифилис делят на две большие группы: неспецифические (это анализ крови RW) и специфические (анализы РНГА, РИФ, ИФА, РИБТ).

• Неспецифические тесты дают положительный результат только когда человек болен, а после выздоровления они будут давать отрицательный результат.
• Специфические тесты позволяют определить в крови человека антитела к болезни. Они могут давать положительные результаты и после излечения, поэтому их редко используют в качестве самостоятельных диагностических тестов.

Чтобы получить максимально точные результаты обычно используют несколько разных тестов, тогда расшифровка анализа крови на сифилис занимает немного больше времени, но и результативность становится выше.

Реакция Вассермана или RW

Реакция Вассермана или RW может показать положительный результат примерно на 5-8 неделе после заражения, но у некоторых больных это происходит позже. По мере поступления возбудителей в кровь титр ее возрастает. Максимума он достигает при вторичном свежем сифилисе. Затем происходит постепенное снижение титра антител, а при поздних формах заболевания реакция Вассермана нередко бывает отрицательной.

Если анализ показывает резкое снижение титра антител во время лечения, то это свидетельствует о его эффективности. Обычно результат расшифровки анализа крови на сифилис выдают в виде цифры: 4 + — резко положительный, 3+ — положительный, 2+ или 1+ слабоположительный или сомнительный, и значок «–» обозначает отрицательный результат анализа.

Главным недостатком анализа RW является его недостаточная специфичность. Он достаточно часто дает ложноположительные результаты у пациентов с другими заболеваниями. Например, такой анализ может быть положительными у пациентов с разнообразными коллагенозами (красной волчанкой, склеродермией, ревматоидным артритом и т.д.), некоторыми инфекционными заболеваниями, например проказой, мононуклеозом, малярией, корью и др., а также с заболеваниями печени, злокачественными новообразованиями, инфарктами миокарда. Ложноположительные результаты бывают и у людей, злоупотребляющих алкоголем и наркотиками, а также у абсолютно здоровых людей. Поэтому при получении положительного анализа на сифилис обычно рекомендуют провести дополнительные исследования при помощи трепонемных тестов.

Метод иммуноферментного анализа

К трепонемным тестам относится ИФА или метод иммуноферментного анализа. При расшифровке анализа крови данным методом можно получить информацию об антителах к сифилису, а также об их титре и принадлежности к определенному классу иммуноглобулинов.

Чтобы получить максимально точный результат анализа на сифилис рекомендуется проводить один нетрепонемный тест (RW) и два трепонемных. Если все три анализа дадут положительный результат, то можно говорить о наличии заболевания у пациента.

Характеристика протеинов изученных изолятов

Ген N всех изученных изолятов кодирует протеин длиной 450 аминокислотных остатков.

У всех изолятов сохраняется серин в позиции 389, который охарактеризован как предположительный сайт фосфорилирования казеинового типа и ассоциирован с регуляцией транскрипции и репликации вирусной РНК (Dietzschold, 1987; Yang, 1999).

Домен связывания РНК в позиции 298-352 (Kouznetzoff, 1998) является высококонсервативным у всех изученных изолятов.

В протеине N были идентифицированы и локализованы антигенные сайты (Goto, 2000). Антигенный сайт I расположен в позиции 358-367, а антигенный сайт IV занимает два участка, один из которых расположен внутри антигенного сайта I (359-366), а другой – в позиции 375-383. Сравнение антигенных сайтов белка N изучаемых полевых изолятов и вакцинного штамма РВ-97 показало, что все изоляты в позиции 364 имеют замену аргинина на лизин. Данные аминокислоты являются полярными положительно заряженными, поэтому, предположительно, эта замена не влияет на антигенные свойства изолятов по сравнению с вакцинным штаммом РВ-97. Изолят №1564 в позиции 379 имеет замену валина на аланин, что также, по-видимому, не влияет на антигенные свойства вируса, поскольку обе эти аминокислоты являются неполярными. Изолят 1410 в позиции 379 имеет замену валина на треонин. Поскольку валин является неполярной аминокислотой, а треонин – полярной незаряженной, возможно, что данная замена повлияла на антигенные свойства протеина N изолята 1564 по сравнению с вакцинным штаммом РВ-97.

Протеин Р

Ген Р всех изученных изолятов кодирует протеин длиной 297 аминокислотных остатков.

В протеине Р выделяют два консервативных домена в позициях 1-50 (CD1) и 201-245 (CD2) и два вариабельных домена в позициях 61-80 (VD1) и 134-180 (VD2) (Nadin-Davis, 1997, 2002). Характерные свойства этих доменов сохраняются в протеине Р изученных изолятов.

Пять остатков серина в позициях 63, 64, 162, 210 и 271 ассоциированы с фосфорилированием протеина Р вируса бешенства (Gupta, 2000). Однако всего 4 изолята лишены отдельных остатков серина в указанных позициях. Так, изоляты №1352, №1410 и №1564 имеют в позициях 64, 63 и 162 замену серина на пролин, соответственно.

Для протеина Р вируса бешенства было показано, что четыре остатка метионина в позициях 20, 53, 69 и 83 используются для начала трансляции (Chenik, 1995). Все указанные остатки метионина сохраняются в изученных изолятах за исключением изолята №1352, у которого в позиции 69 метионин заменен на изолейцин.

Протеин М

Ген М всех изученных изолятов кодирует протеин длиной 202 аминокислотных остатка. В протеине М вируса бешенства различают пролиновый мотив (PPxY), который участвует в почковании вируса и взаимодействует с доменами клеточных компонентов WW (Harty, 1999; Harty, 2001; Kobayashi, 2007). У всех изученных изолятов данный мотив представлен в виде последовательности аминокислот PPEY в позиции 35-38.

Протеин G

Ген G всех изученных изолятов кодирует протеин длиной 524 аминокислотных остатка.

Сайты, связанные с патогенностью вируса бешенства в мышах — Ala-242, Asp-255, Ile-268 и Arg-333 (Takayama-Ito, 2006; Tuffereau, 1989) – сохраняются всех изученных изолятов. Также сохраняется и Lys-330, который участвует в связывании вириона с нейронами (Coulon, 1998).

Для протеина G вируса бешенства охарактеризованы антигенные сайты II (позиции 34-42 и 198-200) и III (позиция 330-338) (Prehaud, 1988). При сравнении полевых изолятов вируса бешенства с вакцинным штаммом RB-97 было установлено, что они идентичны по как по антигенному сайту II, так и по антигенному сайту III.

Протеин L

Ген L всех изученных изолятов кодирует протеин длиной 2127 аминокислотных остатков.

У членов порядка Mononegavirales идентифицировано шесть консервативных доменов (домены I-VI) в протеине L (Poch, 1990), некоторые из которых охарактеризованы как функциональные мотивы. Домен II в позиции 543-563 функционирует как РНК-связывающая область, а домен III в позиции 726-731 охарактеризован как активный сайт полимеразы (Schnell, 1995). Домен VI в позиции 1704-1708, который содержит глициновый мотив (GXGXG), ассоциирован с полиаденилированием или протеин-киназной активностью (Poch, 19990). Все эти функциональные мотивы консервативны в изученных изолятах.

Иммунофлуоресцентный анализ

Третий этап: комплекс антиген — антитело — комплемент обрабатывают люминесцирующей антикомплементарной сывороткой, приготовленной при иммунизации кроликов сывороткой того вида животного, которое служило источником комплемента.

Непрямые варианты МФА можно использовать как для выявления антигенов, так и для определения антител. Кроме того, для постановки двухступенчатого варианта нужно иметь ограниченный набор антивидовых люминесцирующих сывороток (против глобулинов быка, барана, лошади, свиньи и др.), а для антикомплементарного варианта достаточно иметь всего одну люминесцирующую сыворотку против глобулинов морской свинки.

Методика иммунолюминесцентной микроскопии. В практике ветеринарных бактериологических лабораторий используют люминесцирующие сыворотки биофабричного производства. В зависимости от типа флуорохрома люминесцирующие сыворотки обеспечивают либо зеленое свечение объекта (краситель на основе флуоресцеина), либо красное (краситель на основе родамина).

Для проведения иммунолюминесцентной микроскопии следует на обезжиренное тонкое без царапин предметное стекло нанести исследуемый материал. При исследовании органов и тканей животных готовят препараты-отпечатки тонким слоем. Препараты подсушивают на воздухе и помещают в фиксирующую жидкость (этанол — 15 мин, метанол — 5 мин, ацетон — 5 мин). Если необходимо, после фиксации препараты некоторое время можно сохранять в холодильнике. Последовательность и дальнейшие процедуры зависят от применяемого варианта МФА

Реакция нейтрализации. Используется только для определения принадлежности бактерийных токсинов в исследуемом материале для установления активности антитоксических сывороток. В пробирки с равным количеством антигена (в 1мл, например, 1000 смертельных доз столбнячного токсина) добавляют равный объем убывающего количества (убывающей концентрации) специфической гипериммунной антитоксической сыворотки; пробирки помещают в термостат на 1-2 ч. Затем из каждой пробирки смесь-токсин-антитоксин вводят лабораторным животным (по 2 животных на каждую дозу антитоксина). Животные, которым ввели смесь, где произошла нейтрализация токсина, остаются живыми. Наименьшее количество сыворотки, нейтрализовавшее токсин, принимается за единицу активности антитоксической сыворотки (АЕ)

Дата добавления: 2017-02-25; просмотров: 185 | Нарушение авторских прав

Похожая информация:

Поиск на сайте:

Расшифровка результатов

Применение современных тест-систем позволяет получать максимально точные результаты анализа. Для расшифровки результата применяются следующие данные:

• степень интенсивности флюоресценции;
• оттенок флюоресценции;
• периферический характер процесса свечения объекта;
• характеристики морфологии, расположения возбудителя во взятом мазке исследуемого материала и его размеры.

Во время исследования объектов, имеющих крупные размеры (например, гарденереллы, трихомонады, клетки, которые уже поражены вирусами), перечисленные выше критерии дают возможность получения максимально достоверных результатов. Однако элементарные тела микоплазмы и хламидий обладают размерами, лежащими на пределе разрешающих способностей люминесцентного микроскопа, что затруд

няет получение точного результата, поскольку периферическое свечение теряет часть своей интенсивности. Оставшиеся критерии уже недостаточны для точной идентификации исследуемых микроорганизмов. По этой причине особые требования предъявляются к специалистам, которые проводят данный вид исследования: уровень их квалификации должен быть достаточным для оперирования имеющимися данными.

По этой причине расшифровкой полученного анализа может заниматься только врач с соответствующим уровнем квалификации. Про цену на исследование методом РИФ читайте ниже.

Виды такой процедуры

Сегодня применяется несколько разновидностей данного анализа, каждый из которых имеет ряд специфических особенностей и позволяет получить максимально развернутую картину процессов, происходящих в организме.

К разновидностям реакции иммунофлуоресценции следует отнести:

1. — один из наиболее бурно развивающихся видов диагностики, этот анализ дает возможность получения количественных данных без применения серийных разведений. Благодаря использованию полученных измерений оптической плотности жидкости получается точно определить уровень концентрации нужного компонента. Широкие возможности данного вида анализа используются при использовании для его осуществления моноклональных антител, что позволяет определить фазу инфекционного процесса, его остроту;
2. ДНК-диагностика
   — данный метод основан на комплементарном связывании нуклеотидов, для чего могут использоваться такие жидкости, как слюна, кровь, ликвор, моча, мокрота, биоптаты, кровь. Данный метод наиболее эффективно позволяет выявить наличие в организме вирусов папилломы, однако многие современные тест-системы могут изредка давать ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Причиной их может быть загрязнения проб жидкости для проведения анализа специфической ДНК, наличие которой может иметь гнездный или тотальный характер;
3. иммунохромотография
   — специфика этого способа определения наличия в организме патологической среды и вирусов состоит в применении в ходе реакции меченых антител. Используется данный метод диагностики для выявления и степени активности процесса заражения стрептококками группы А, а также хламидиями следующих видов: Clamikit R Innotech International, Clearview TM Chlamydia фирмы Oxoid. Обладая максимально высокой чувствительностью, тест-системы, которые основаны на данной методике исследования. применяются обычно как ориентировочный тест.

Перечисленные разновидности имеют особенности проведения и специфические характеристики результатов, однако все они направлены на получение данных о наличии в организме патологических микроорганизмов и вирусов, а также о степени их размножения и активности.

Кому ее назначают

Проведение реакции иммунофлуоресценции может назначаться при диагностике множества вирусных заболеваний. В частности, ее назначают при комплексном обследовании на выявление следующих факторов:

• наличие в организме вируса ;
• заражение сальмонеллой;
• существование в организме определенных антигенов;
• выявляется вероятность заражения организма хламидиями, микоплазмами и другими микроорганизмами, имеющими способность к возбуждения вирусных заболеваний человека;
• диагностика вирусных болезней у животных.

Перечисленные показания позволяют использовать реакцию иммунофлуоресценции при выявлении в организме человека и животных вирусных заболевания различной природы.

Виды такой процедуры

Сегодня применяется несколько разновидностей данного анализа, каждый из которых имеет ряд специфических особенностей и позволяет получить максимально развернутую картину процессов, происходящих в организме.

К разновидностям реакции иммунофлуоресценции следует отнести:

1. — один из наиболее бурно развивающихся видов диагностики, этот анализ дает возможность получения количественных данных без применения серийных разведений. Благодаря использованию полученных измерений оптической плотности жидкости получается точно определить уровень концентрации нужного компонента. Широкие возможности данного вида анализа используются при использовании для его осуществления моноклональных антител, что позволяет определить фазу инфекционного процесса, его остроту;
2. ДНК-диагностика
   — данный метод основан на комплементарном связывании нуклеотидов, для чего могут использоваться такие жидкости, как слюна, кровь, ликвор, моча, мокрота, биоптаты, кровь. Данный метод наиболее эффективно позволяет выявить наличие в организме вирусов папилломы, однако многие современные тест-системы могут изредка давать ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Причиной их может быть загрязнения проб жидкости для проведения анализа специфической ДНК, наличие которой может иметь гнездный или тотальный характер;
3. иммунохромотография
   — специфика этого способа определения наличия в организме патологической среды и вирусов состоит в применении в ходе реакции меченых антител. Используется данный метод диагностики для выявления и степени активности процесса заражения стрептококками группы А, а также хламидиями следующих видов: Clamikit R Innotech International, Clearview TM Chlamydia фирмы Oxoid. Обладая максимально высокой чувствительностью, тест-системы, которые основаны на данной методике исследования. применяются обычно как ориентировочный тест.

Перечисленные разновидности имеют особенности проведения и специфические характеристики результатов, однако все они направлены на получение данных о наличии в организме патологических микроорганизмов и вирусов, а также о степени их размножения и активности.

Значение и перспективы метода[ | код]

Метод имеет решающее значение в ранней диагностике и лечении онкологических заболеваний (иммуногистохимия, онкогематология), диагностике инфекционных заболеваний (например определение CD4+ клеток при ВИЧ) и наследственных синдромов. Интенсивно развиваются автоматизированные методы, среди которых направления высокоинформативной микроскопии (high content imaging) и высокоинформативной цитометрии(high content cytometry),параллельно развивающиеся с 90х годов комбинированные методики цитометрии-микроскопии (цитометр-микроскоп), а также методы микрочиповой цитометрии с плазмонной голографией в которых отдельные антитела метятся наночастицами.

Примечания[ | код]

1. ↑A. H. Coons, H. J. Creech, R. N. Jones, E. Berliner (нем.)русск., The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody, J. Immunol.45, 1942, pp. 159—170
2. ↑A. H. Coons, M. H. Kaplan, Localization of antigen in tissue cells. II. improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody, J. Exp. Med., 91(1), pp. 1-13
3. ↑On-Chip Cytometry using Plasmonic Nanoparticle Enhanced Lensfree Holography : Scientific Reports : Nature Publishing Group

Метод флуоресцирующих антител (МФА) (иначе реакция иммунофлуоресценции – РИФ) используется для обнаружения антигенов в биологических объектах (микроорганизмах, жидкостях) с помощью антител, помеченных флуоресцирующими красителями.

Первый люминесцентный микроскоп с кварцевой оптикой был сконструирован еще в 1908г. Келером и Зидентопфом. Сам метод иммунофлуоресценции был изобретен в 1942г. А. Кунсом, синтезировавшим органический краситель флуоресцеин-4-изоцианат, и  разработавшим методику его конъюгирования с сывороточными белками.

Различают прямой (пМФА) или  реакция  прямой иммунофлуоресценции  (РПИФ), разработан. А Кунсом и Каплан. Непрямой (нМФА) метод флуоресцирующих антител или  реакция непрямой иммунофлуоресценции  (РнИФ), разработан Кунсом и Уиллером и, как разновидность последнего нМФА с комплементом.

ПМФА  используется с  целью выявления антигенов в биологических пробах на основе известных сывороток.

Методика пМФА. На предметном стекле фиксируется мазок или отпечаток ткани, содержащий антиген. На этот мазок наносится флуоресцирующая сыворотка, содержащая антитела против предполагаемого антигена. В качестве контроля используется гетерологичная флуоресцирующая сыворотка. В течение 30 мин.мазки с нанесенной сывороткой выдерживают во влажной камере при +37°С затем их промывают, удаляя лишний флуоресцин. Сыворотка, связываясь с антителом, образует комплекс, включающий флуоресцин, как опознавательный маркер. Оценка результатов осуществляется люминесцентным микроскопированием  по уровню яркости зеленого свечения, описывается в крестах.

“+++++” – яркая, сверкающая флуоресценция;

“+++” – отчетливо выраженная, достаточно яркая флуоресценция;

“++” —  флуоресценция  слабая, но морфология   клеток   и   цвет  люминесценции выявляется достаточно четко;

“+” —  флуоресценция  очень   слабая,   морфология   клеток различима плохо;

“-” – флуоресценция отсутствует.

НМФА используется с целью выявления специфических антител в биологических пробах.

Методика нМФА. При проведении нМФА на известный, фиксированный на стекле антиген, наносят испытуемую сыворотку и в течение 30 мин. мазки с нанесенной сывороткой выдерживают во влажной камере при +37°С. Затем наносят антивидовой (соответствующий     испытуемой  сыворотке) люминесцирующий  гамма-глобулин и  вновь  выдерживают во влажной камере. Далее препараты промывают, высушивают и исследуют люминесцентной микроскопией. Титром сыворотки считают то наибольшее ее разведение, которое обусловливающее свечение на “++”,  при наличии свечения на “+++” или “++++” в предыдущем разведении.

Модификацией нМФА, является нМФА с комплементом. В этом случае к сыворотке, нанесенной на антиген, добавляется комплемент, а к нему уже антикомплементарная люминесцирующая сыворотка.

Преимуществом непрямых методов является необходимость наличия только видовых люминесцирующих сывороток. При этом реакция становится более громоздкой из-за большого количества необходимых контролей. К недостаткам всех видов РИФ относится ограниченная чувствительность из-за наличия возможных перекрестных реакций между близкими по антигенному составу объектами и неспецифическая флуоресценция вследствие адсорбции флуоресцирующей сыворотки на различных элементах препарата.

РИФ применяется в настоящее время для идентификации возбудителей различных вирусных инфекций, бешенства,  колиэнтеритов, дизентерии, гепатита, брюшного тифа и паратифов, холеры, коклюша, чумы, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы, сифилиса, токсоплазмоза, хламидиоза, и др.

Для лабораторных исследований используются коммерческие стандартные конъюгаты, содержащие глобулины к исследуемым антигенам.

Список литературы:

1. Р. Кирк Д. Бонагура Современный курс ветеринарной медицины Кирка. М., “Аквариум” 2005г.

2. Х.Г. Ниманд  П.Ф. Сутер Болезни собак. М., “Аквариум” 1998г.

3. Бусыгин К.Ф. Люминесцентная диагностика инфекционных болезней животных М., “Колос” 1975г.

4.Сюрин В.М Самуйленко А.Я. и др.

Кому ее назначают

Проведение реакции иммунофлуоресценции может назначаться при диагностике множества вирусных заболеваний. В частности, ее назначают при комплексном обследовании на выявление следующих факторов:

• наличие в организме вируса ;
• заражение сальмонеллой;
• существование в организме определенных антигенов;
• выявляется вероятность заражения организма хламидиями, микоплазмами и другими микроорганизмами, имеющими способность к возбуждения вирусных заболеваний человека;
• диагностика вирусных болезней у животных.

Перечисленные показания позволяют использовать реакцию иммунофлуоресценции при выявлении в организме человека и животных вирусных заболевания различной природы.

Расшифровка результатов

Применение современных тест-систем позволяет получать максимально точные результаты анализа. Для расшифровки результата применяются следующие данные:

• степень интенсивности флюоресценции;
• оттенок флюоресценции;
• периферический характер процесса свечения объекта;
• характеристики морфологии, расположения возбудителя во взятом мазке исследуемого материала и его размеры.

Во время исследования объектов, имеющих крупные размеры (например, гарденереллы, трихомонады, клетки, которые уже поражены вирусами), перечисленные выше критерии дают возможность получения максимально достоверных результатов. Однако элементарные тела микоплазмы и хламидий обладают размерами, лежащими на пределе разрешающих способностей люминесцентного микроскопа, что затруд

няет получение точного результата, поскольку периферическое свечение теряет часть своей интенсивности. Оставшиеся критерии уже недостаточны для точной идентификации исследуемых микроорганизмов. По этой причине особые требования предъявляются к специалистам, которые проводят данный вид исследования: уровень их квалификации должен быть достаточным для оперирования имеющимися данными.

По этой причине расшифровкой полученного анализа может заниматься только врач с соответствующим уровнем квалификации. Про цену на исследование методом РИФ читайте ниже.

Что такое реакция иммунофлуоресценции

Представляя собой отличную возможность для быстрого получения точного диагноза, реакция иммунофлуоресценции позволяет определить наличие возбудителя заболевания в патологическом материале.
Для этого применяется мазок из материала, который специальным образом обрабатывается с помощью меченого ФИТЦ (флюоресцеина изотиоцианатом), и изучается в качестве гетерогенного анализа.

Для получения результата применяется люминесцентного микроскопа, в его оптической системе находится набор светофильтров для обеспечения препарата сине-фиолетовым либо ультрафиолетовым светом, имеющий заданную длину волны. Данное условие позволяет флюорохром отсвечивать при заданном диапазоне. Исследователем оцениваются свойства свечения, его характер, размеры объектов и их взаиморасположение.

Расшифровка результатов

Применение современных тест-систем позволяет получать максимально точные результаты анализа. Для расшифровки результата применяются следующие данные:

• степень интенсивности флюоресценции;
• оттенок флюоресценции;
• периферический характер процесса свечения объекта;
• характеристики морфологии, расположения возбудителя во взятом мазке исследуемого материала и его размеры.

Во время исследования объектов, имеющих крупные размеры (например, гарденереллы, трихомонады, клетки, которые уже поражены вирусами), перечисленные выше критерии дают возможность получения максимально достоверных результатов. Однако элементарные тела микоплазмы и хламидий обладают размерами, лежащими на пределе разрешающих способностей люминесцентного микроскопа, что затруд

няет получение точного результата, поскольку периферическое свечение теряет часть своей интенсивности. Оставшиеся критерии уже недостаточны для точной идентификации исследуемых микроорганизмов. По этой причине особые требования предъявляются к специалистам, которые проводят данный вид исследования: уровень их квалификации должен быть достаточным для оперирования имеющимися данными.

По этой причине расшифровкой полученного анализа может заниматься только врач с соответствующим уровнем квалификации. Про цену на исследование методом РИФ читайте ниже.

Что такое реакция иммунофлуоресценции

Представляя собой отличную возможность для быстрого получения точного диагноза, реакция иммунофлуоресценции позволяет определить наличие возбудителя заболевания в патологическом материале.
Для этого применяется мазок из материала, который специальным образом обрабатывается с помощью меченого ФИТЦ (флюоресцеина изотиоцианатом), и изучается в качестве гетерогенного анализа.

Для получения результата применяется люминесцентного микроскопа, в его оптической системе находится набор светофильтров для обеспечения препарата сине-фиолетовым либо ультрафиолетовым светом, имеющий заданную длину волны. Данное условие позволяет флюорохром отсвечивать при заданном диапазоне. Исследователем оцениваются свойства свечения, его характер, размеры объектов и их взаиморасположение.

Сущность и технология

Сущность иммунофлуоресцентного метода состоит в визуализации антигенов специфичными антителами (связка «антиген-антитело») при помощи флуоресцентных маркеров.
Образцами для проведения иммунофлуоресцентного анализа являются клеточные суспензии (культуры бактерий, вирусов, клеток, микоплазм, риккетсий), образцы костного мозга, крови, тонких срезов ткани и альвеолярных смывов.
Оценка и исследование могут осуществляться вручную с помощью флуоресцентного микроскопа или в автоматическом режиме с применением проточного цитометра, а также микрочипового цитометра. Кроме этого, применяются конфокальный микроскоп и флуоресцентный роботизированный микроскоп (также в соединении с проточным цитометром) одновременно с программным обеспечением для обработки изображений. С помощью существующих на данный момент автоматизированных технологий можно анализировать до пятидесяти разных антигенов в одном образце с применением разнообразных флуоресцентных маркеров в рамках цитометрии и высокоинформативной микроскопии. Примерно до двадцати пяти антигенов одновременно можно исследовать при помощи конфокальной микроскопии или же проточной цитометрии.

Противопоказания для проведения

Поскольку для проведения данной реакции в качестве исследуемого материала требуется любой вид жидкости организма, взятие их обычно не составляет трудностей и противопоказаний для осуществления реакции иммунофлуоресценции не существует

Однако при беременности и у детей до 6 месяцев взятие материала для исследования проводится с максимальными предосторожностями

Отсутствие противопоказаний позволяет осуществлять проведение данного вида диагностики при назначении врача всем пациентам. Безопасность ее гарантируется использованием дезинфицированным инструментом и одноразовыми шприцами.